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CD40配体对汉黄芩素抗肿瘤作用的影响及其机理讨论

作者:初中教育
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-25

CD40属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族,主要在B细胞,造血前体细胞,T细胞,单核细胞/巨噬细胞,树突状细胞和各个不同的分化阶段表达。组织来源的肿瘤细胞。 CD40配体(CD40L)属于TNF超家族。 CD40与其配体CD40L结合,提供T细胞和B细胞活化所必需的第二种信号,并广泛参与细胞,体液和炎症反应的调节。 CD40和CD40L在肿瘤细胞表面的结合对不同类型的肿瘤细胞发挥不同的调节作用。在许多肿瘤细胞中,可以防止细胞生长并且可以诱导肿瘤细胞的凋亡。因此,CD40L具有潜在的抗肿瘤应用前景。

花黄素(5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮,沃贡宁)是从中草药黄芪中提取的有效成分。大量研究表明,wogonin具有广泛的生物学活性,包括抗氧化,抗病毒,抗血栓形成和抗炎作用。近年来,wogonin的抗肿瘤作用引起了人们的关注,体外和体内研究表明,它对肿瘤的生长具有抑制作用,可以有效杀死肿瘤细胞。

基于CD40L和wogonin,在肿瘤治疗中具有潜在的应用前景。在这项研究中,重组可溶性CD40L(rsCD40L)被用于激活CD40,卵巢癌细胞系SKOV3被用作研究对象。通过比较rsCD40L,单独的黄ical素和两者的结合,结合SKOV3细胞的杀伤作用,研究了rsCD40L对wogonin的抗肿瘤作用,并通过凋亡和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和免疫蛋白。通过Western印迹检测与凋亡信号通路相关的蛋白质的表达机制。

1材料与方法

1.1细胞系和主要试剂

人卵巢癌细胞系SKOV3购自American American Culture Collection;高葡萄糖DMEM(Gibco);胎牛血清(Hyclone);黄cut苷(中国药品生物制品检定所); USA啶橙/溴化乙锭(AO/EB),购自美国Sigma;泛半胱天冬酶制剂Z-VAD-FMK(Calbiochem); CytoTox 96○R非放射性细胞毒性测试试剂盒(Promega);抗caspase-3抗体(Epitomics);抗caspase-8抗体和抗聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抗体购自BD Bioscience; TNF-α中和抗体,rsCD40L,抗β-肌动蛋白抗体(Protein Tech);化学发光底物溶液(Millipore)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

SKOV3在高葡萄糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)中培养,在5%CO2、37°C和饱和湿度下培养。当细胞超过80%(3-4天)时,使用0.25%的胰蛋白酶溶液。消化后通过。

1.2.2实验分组

过夜生长后,将SKOV3细胞分为rsCD40L1μg/mL(添加0.5、1.0、2.0μg/mL的rsCD40L细胞死亡率测定)或wogonin10μmol/L(测定黄5,5、10、15μmol/L的细胞死亡率)。单一药物组,以及两种药物的组合,并设立一个对照组,每个药物浓度设置4个孔。

1.2.3细胞死亡率的测定

将SKOV3细胞接种在96孔板中,并以1.2.2的组添加不同的药物。将细胞进一步培养72小时,并根据CytoTox 96 R试剂盒的说明书测量培养上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性,并测量细胞死亡率。分别测量细胞培养上清液的吸光度(A)值和细胞的最大释放A值。根据以下公式计算细胞死亡率:细胞死亡率(%)=细胞培养上清液A值细胞最大释放A值×100%。

1.2.4 AO/EB染色检测细胞凋亡

将SKOV3细胞接种在48孔板中过夜,并根据1.2.2加入不同的药物。培养持续24小时。除去上清液,用PBS溶液轻轻洗涤并除去,最终浓度为50μg/mL。 5分钟后弃去AO/EB染料溶液,加入少量PBS,在荧光显微镜下观察并照相。早期凋亡细胞的核染色质呈绿色浓缩或呈串珠状,晚期凋亡细胞的核染色质呈橙红色且浓缩或呈串珠状。

1.2.5毫米E!

Western blot用于检测凋亡信号通路相关蛋白的表达。将SKOV3细胞接种在48孔板中过夜,并根据1.2.2加入不同的药物。加入药物后14h和24h用PBS洗涤后,收集细胞并加入M2。通过裂解物裂解细胞,在冰上温育30分钟,在4℃下离心,并且收集上清液以获得细胞裂解物。使用BIO-RAD样品分析试剂确定蛋白质浓度后,将等量(约50μg)的细胞裂解液添加到上样缓冲液中,煮沸4分钟,然后使用120 g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后转移PVDF膜。将转移的膜在室温下放入含有5%脱脂奶粉的PBS-T(PBS中含有0.1%Tween20)和相应的一抗(caspase-3抗体1:500; caspase-8抗体1)中放置1小时:500; PARP抗体1:1 000; β-肌动蛋白抗体1:2000)PBS在室温下孵育2小时或在4°C过夜,用PBS-T洗涤后,添加相应的辣根过氧化物酶标记。将二抗在室温下孵育40分钟,然后用PBS-T洗涤后,添加化学发光底物溶液,并通过凝胶成像系统检测特定的蛋白带。

1.2.6 ELISA法检测TNF-α水平

将SKOV3细胞接种到48孔板中过夜,然后以1.2.2的组添加不同的药物。 12小时后,收集上清液,并通过人TNF-α包被的ELISA试剂盒测量细胞培养上清液中的TNF-α水平。

1.2.7 Z-VAD-FMK,TNF-α中和抗体

rsCD40L和黄ical素的组合对癌细胞死亡的影响在我们以前的研究中发现rsCD40L可以诱导SKOV3细胞自分泌TNF-α,而另一项研究发现黄ical素和TNF-α的组合可以协同杀死癌细胞。为了研究联合治疗组癌细胞的自分泌TNF-α,我们发现rsCD40L可以诱导SKOV3细胞自分泌TNF-α。将TNF-alpha中和抗体(1ug/mL)在细胞死亡中的作用预处理1小时,然后再加入1 ug/mL rsCD40L + 10 micromol/L黄ical素(rsCD40L + Wogonin + anti-TNF)和非特异性抗体( rsCD40L + Wogonin + anticontrol)作为对照组,无药物作为阴性对照。加入rscd40l(1μg/ml)和10μmol/L hanhuangling作为rscd40l + Wogonin组。此外,将细胞用20 micromol/L ZVAD-FMK预处理30分钟,然后用rsCD40L(1 ug/mL)+10 micromol/L黄ical素(rsCD40L + Wogonin + Z-VAD-FMK组)处理。处理72小时后,通过1.2.3方法测量细胞死亡率。

1.2.8 Z-VAD-FMK与rsCD40L和黄ical素联合使用

通过1.2.7阴性对照组,rsCD40L + Wogonin组,rsCD40L + Wogonin + ZVAD-FMK组的1.2.4和1.2.5方法检测凋亡和凋亡信号通路的激活对肿瘤细胞凋亡的影响。

1.2.9统计方法

数据以x+s表示,组间比较采用单因素方差分析。两组比较采用t检验,p<;0.05有显著性差异。两药合用时,按周他来公式计算协同指数(ci)。

2个结果

2.1rscd40l对黄芩素细胞毒性的影响

用rscd40l治疗72小时后,即使rscd40l浓度最高(2ug/ml),skov3细胞也仅死亡(14.4%+0.7%)。(RSCD40L单药治疗组p>0.05)。15微摩尔/升黄芩素可导致约24.8%+2.6%的细胞死亡(黄芩素单药组P<;0.05),而RSCD40L和汉黄可导致约24.8%+2.6%的细胞死亡(黄芩素单药组P<;0.05)。黄芩苷联合用药组细胞死亡率高于单药组,差异有统计学意义(P<;0.05,P<;0.01)。固定rscd40l浓度(1ug/ml)和添加不同浓度黄芩素时,skov3细胞的死亡率随黄芩素浓度的增加而增加(p<;0.05,差异有统计学意义)。ci分析结果显示,其ci值小于1,即rscd40l增强黄芩素的抗肿瘤作用属于协同效应。

2.2 RSCD40L和灯盏花素单独和联合使用

skov3细胞凋亡的作用如图1所示。对照组未见凋亡细胞。单药组可见少量早、晚期凋亡细胞。rscd40l与黄芩素联合治疗组可见大量凋亡细胞。

2.3 RSCD40L与黄芩素单独及联合使用

skov3细胞凋亡信号途径蛋白激活的影响。rscd40l与黄芩素联合应用可促进凋亡因子caspase-8(相对分子量55x 103)活化和降解为不同片段(40x103、36x103、23x103),并促进caspase-3(相对分子量32x103)的活化及其在细胞内的分布。基质parp蛋白(相)。将113×103的分子量切成小片段(相对分子量为89×103),与对照组和单药组比较差异有显著性。

2.4rscd40l和黄芩素对skov3细胞的联合作用

对照组、rscd40l组、黄芩素组、rscd40l+黄芩素组上清液中tnf-α的含量分别为6.47(+0.6)、61.91(+2.4)、5.37(+0.4)和59.00(+1.6)。单用rscd 40l和黄芩素联合应用均能提高skov3细胞上清液中tnf-α的水平(p均lt&0.01);单用汉黄芩素不增加tnf-α的分泌(p<0.05)。

2.5 Z-VAD-FMK和TNF-α中和抗体

如表3所示,z-vad-fmk预处理可抑制rscd40l与黄芩素联合作用引起的细胞死亡(p<;0.01)。用tnf-α中和抗体预处理skov3细胞可抑制rscd40l与黄芩素联合应用的抗肿瘤作用。

2.6 Z-VAD-FMK

rsCD40L和汉黄芪对肿瘤细胞凋亡和凋亡信号通路激活的影响如图3所示。用rsCD40L和黄ical素处理的细胞中可见大量凋亡细胞,即核染色质为绿色或橙色。红色,浓缩或串珠的Z-VAD-FMK预处理细胞可抑制rsCD40L和wogonin组合诱导的凋亡,并且在视野下未观察到凋亡细胞。

3讨论

化学疗法仍然是许多恶性肿瘤临床治疗的主要方法。尽管各种各样的化学治疗药物已经在临床实践中被广泛使用,但是仍然存在诸如患者对药物的耐受性或药物的主要副作用以及发现新的高效率和低毒性的问题。新的抗肿瘤药物和新策略已成为国内外癌症研究的重点。

近年来,许多研究表明CD40/CD40L信号通路的激活可以起到抗肿瘤的作用。一方面,由于CD40/CD40L信号通路在调节获得性免疫应答中起着重要作用,因此激活该信号通路可以增强机体的特异性抗肿瘤免疫应答[13]。另一方面,由于CD40分子也表达在许多癌细胞的表面,因此可以在与CD40L结合并激活后转移到细胞中。凋亡信号导致许多肿瘤中的细胞凋亡。其他研究表明,同时激活癌细胞表面的CD40可以增强癌细胞对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL),Fas配体和许多化疗药物的敏感性。黄ical素作为一种具有抗肿瘤作用的天然化合物,在杀死癌细胞的同时对正常细胞的毒性较小,具有广阔的应用前景。结果表明,rsCD40L和黄ical素的结合可增强癌细胞的杀伤力,增加癌细胞的死亡率,并在形态上表现出典型的凋亡特征。主要机制是增强细胞凋亡信号通路的激活(Caspase-8和caspase-3的激活以及PARP裂解均显着增加)。半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK可以显着抑制组合组的细胞死亡,这进一步支持rsCD40L和黄ical素的组合可以主要通过增强肿瘤细胞的凋亡来促进细胞死亡。 rsCD40L与黄cut苷的协同作用分析表明,CI值小于1,即rsCD40L增强了黄cut苷诱导的抗肿瘤作用,属于协同作用。

作为TNFR家族的成员,CD40与TNFR家族的其他成员不同,在其细胞内结构域中没有死亡结构域,因此它不能直接激活细胞死亡信号传导途径,而是通过诱导其他细胞毒性因子的产生来诱导细胞死亡。例如Fas配体,TNF-α和TRAIL。在我们以前的研究中,我们发现卵巢癌细胞系SKOV3在其表面表达CD40分子。 rsCD40L可通过诱导SKOV3细胞分泌TNF-α来增强其对顺铂的敏感性。在另一项研究中,我们发现黄ical素和TNF-α的组合可促进癌细胞的凋亡,其机制与黄e素对TNF-α诱导的NF-κB信号通路激活的阻断有关。在这项研究中,我们还发现单独处理的rsCD40L和经黄cut苷处理的rsCD40L的细胞培养上清液中TNF-α的浓度显着增加,并且rsCD40L和黄ical素的组合可显着抑制rsCD40L和黄ical素的组合诱导的细胞毒性。表明rsCD40L可以通过自分泌TNF-α增强Han。黄ical素的抗肿瘤作用。

总之,我们的结果表明,rsCD40L和黄ical素的组合可能是杀死癌细胞的一种新的有效策略,但是在体内还需要进一步的研究。

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