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基质金属蛋白酶及粘着斑激酶在单疱病毒性角膜炎中的表达及调节机

作者:投资理财
出处:www.lunrr.com
时间:2019-12-24

1.本文构建了体外培养的角膜上皮细胞系,并首次研究了基质金属蛋白酶-2在单纯疱疹病毒-1 (HSV-1)体外培养的角膜上皮细胞系中的表达。 本研究成功地将HSV-1转染到体外培养的HCE细胞中,并在感染早期检测基质金属蛋白酶-2基因和蛋白表达。感染前2天角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2蛋白表达的变化得到证实,表明感染早期上皮细胞合成的基质金属蛋白酶-2在角膜基质溃疡的形成中起着重要作用。

2。本文探讨了FAK信号通路与单纯疱疹病毒性角膜炎发病机制的关系,但这一研究在国际上未见报道。 观察基质金属蛋白酶-2、黏着斑激酶(FAK)和磷酸化黏着斑激酶(荧光素-FAK)在HSV-1感染角膜上皮细胞中的表达及其相关性 据信FAK的大量表达与激活基质金属蛋白酶-2和其他细胞因子的表达有关。磷酸化FAK在病毒入侵细胞和基质金属蛋白酶-2激活中起重要作用,并促进角膜基质溃疡的形成。 目的研究基质金属蛋白酶(基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9)在型单纯疱疹病毒(HSV-1)所致角膜炎中的表达,探讨基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9的表达与角膜基质炎症病程变化的关系

方法将20只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组5只,每只小鼠右眼为实验眼。 1型单纯疱疹病毒(HSV-1)划伤角膜上皮后诱发单纯疱疹性角膜炎 每天在裂隙灯下观察小鼠角膜的变化,分别在感染后0、2、7、14天处死小鼠,收集感染后的角膜。 从角膜组织中提取总核糖核酸,反转录成cDNA,聚合酶链反应扩增,扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳,计算机凝胶成像系统图像提取,电泳带灰度值分析 采用方差分析SNK-q检验对实验数据进行半定量分析

结果感染小鼠出现典型的单纯疱疹性角膜炎。感染后第2天观察到树突状上皮缺损,随后出现浅表间质炎症和炎性细胞浸润。角膜基质水肿、基质浸润、溃疡形成和新生血管在第7天逐渐恶化 除了感染后第0天组中的5个基质金属蛋白酶-9基因样品外,所有组均获得阳性靶片段 随着感染天数的增加,基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的表达增加。 感染后第1天和第2天基质金属蛋白酶-2基因表达无显着性差异(P0.05)。感染后第7天和第14天,基质金属蛋白酶-2的表达逐渐增加(P0.05),其他各组差异有显着性(P0.01)

结论基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9基因在实验性单纯疱疹病毒角膜基质炎症中表达,随着角膜炎反应的加剧、溃疡范围的扩大和新生血管的增多,其表达逐渐增加。 据推测,基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9的高表达与角膜溃疡、新生血管和其他病理变化的发生有关。

[关键词]单纯疱疹病毒角膜基质炎症基质金属蛋白酶逆转录聚合酶链反应

实验性小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎中黏着斑激酶的第二部分表达

目的:探讨单纯疱疹病毒型(HSV-1)感染BalB/c小鼠角膜后黏着斑激酶(FAK)表达的变化

方法:用HSV-1感染的BalB/c小鼠角膜建立单纯疱疹病毒感染模型,用免疫组织化学方法检测FAK的表达。

结果:单纯疱疹病毒性角膜炎模型角膜上皮细胞排列紊乱,基质水肿,中性粒细胞增多,FAK阳性细胞增多,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P 0.05)

结论:实验性小鼠单纯疱疹病毒性角膜炎动物模型角膜上皮细胞中检测到大量FAK表达,其表达趋势随着感染时间的延长呈上升趋势

[关键词]单纯疱疹病毒角膜基质炎性黏着斑激酶

第三部分HSV-1感染人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和FAK表达的研究

目的:探讨单纯疱疹病毒-1 (HSV-1)感染对体外培养人角膜上皮细胞基质金属蛋白酶-2和FAK表达的影响

方法:用HSV-1菌株感染体外培养的人角膜上皮细胞(HCE)。聚合酶链反应、蛋白质印迹、免疫组织化学和免疫荧光分别检测HCE基质金属蛋白酶-2和黏着斑激酶(FAK)的表达。

结果:感染后2h、20h和40h,基质金属蛋白酶-2和FAK基因的表达分别显着高于未感染细胞(P0.01、P005);感染后20小时和40小时,基质金属蛋白酶-2、FAK、FAK蛋白表达与未感染细胞差异显着(p0.05)。其他组间差异有统计学意义(P0.01),总体上呈感染后表达随天数增加而增加的趋势。

结论基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9基因在HSK角膜中有表达。随着炎症反应的加剧,表达增加。这种酶被证明有助于角膜响应单纯疱疹病毒感染的溃疡和新生血管形成过程。

[关键词]单纯疱疹病毒;角膜炎;基质金属蛋白酶;逆转录聚合酶链反应

第二部分:黏着斑激酶在实验性单纯疱疹病毒性角膜炎中的表达

目的探讨黏着斑激酶(FAK)在疱疹性基质角膜炎中的表达。

方法:用HSV-1病毒感染24只BalB/c小鼠角膜,建立单纯疱疹病毒性角膜炎模型。另外六只老鼠作为阴性对照。免疫组织化学染色检测FAK表达。

结果3360 HSK模型角膜上皮细胞紊乱,中性粒细胞和FAK阳性细胞增多;与阴性对照组相比,差异有显着性(P0.05)。感染细胞在20和40小时时与对照细胞有显着差异(P0.05)。病毒感染细胞在2小时时的FAK、FAK和基质金属蛋白酶-2表达与20小时和40小时时有显着差异(P0.05)。免疫组织化学染色结果表明,感染时间越长,基质金属蛋白酶-2、FAK和FAK阳性细胞的数量越多。

结论角膜上皮HSV-1感染后,FAK信号通路激活,导致角膜组织基质金属蛋白酶-2分泌增加,加速角膜溃疡和坏死病变的形成。

关键词:疱疹性基质角膜炎;基质金属蛋白酶;黏着斑激酶途径

简介

单纯疱疹病毒型(HSV-1)感染引起的单纯疱疹性角膜炎是目前国内外最常见的致盲眼病,复发率高,致盲率高,对视觉功能影响严重 在过敏性紫癜中,组织损伤和失明主要是由炎症组织的免疫反应引起的,而不是直接由病毒毒性引起的 病毒在角膜实质内复制并引起银抗体免疫反应,导致严重的病理变化,如角膜溃疡、新生血管和角膜瘢痕。

基质金属蛋白酶(MMPs)是降解细胞外基质(ECM)及基底膜成分的一族蛋白裂解酶,至今已发现了至少26种。ECM主要包括胶原,蛋白多糖,糖蛋白,糖胺多糖和弹力纤维五大类。其中胶原是ECM中最丰富的结构成分。MMPs几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质成分。所有MMPs均有以下理化特征:1 均以潜酶形式分泌,其前肽内含有一个半胱氨酸开关和两个高度保守区。一个高度保守区位于催化中心(含锌结合位点),另一个高度保守区位于N末端;2 均含有2个锌离子,其中一个位于催化中心为酶活性所必需的辅助因子;3 均含有2个钙离子,参与酶活性的激活并为酶活性的稳定所必需;4 均为内肽酶,能从肽链中间裂解底物;5 其酶活性能为相应的特异性抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs)所抑制,此外MMPs还受到基因表达,酶原激活等多种不同水平上的调节。在体内MMPs参与了多种生理和病理过程,如形态发生,血管形成,结缔组织重建,损伤修复和肿瘤转移等。MMPs在多种生理及病理反应中发挥作用,如在角膜伤口愈合过程中可见角膜上皮细胞,基质细胞及中性粒细胞分泌多种MMPs以促进基底膜重塑,创面收缩,坏死组织清除及纤维修复组织沉积。当MMPs过度表达则可导致溃疡形成。 另一个例子是,在新生血管形成过程中,可以在血管内皮细胞和基质成纤维细胞中检测到基质金属蛋白酶-2,并且基质金属蛋白酶-9的表达可以通过直接降解基质或释放基质结合因子和生长因子来促进血管生成 同样,炎症细胞和角膜组织本身也能在单纯疱疹病毒感染角膜后产生基质金属蛋白酶,并在角膜组织的某些病理变化中发挥重要作用

以往的研究表明,角膜细胞和角膜上皮细胞产生的[1],基质金属蛋白酶-2在单纯疱疹性角膜炎(HSK)的发展中起着重要作用,主要导致单纯疱疹病毒型(HSV-1)感染角膜后角膜溃疡的形成 然而,上述研究结果仅证实了基质金属蛋白酶-2在热休克模型中的表达和活性变化,尚不清楚热休克引起基质金属蛋白酶-2表达、分泌和活性变化的机制。 根据国内外相关研究结果,我们推测可能的机制有:(1)病毒感染直接激活角膜上皮细胞和中性粒细胞的细胞内信号通路,上调基质金属蛋白酶的表达水平,刺激上述细胞分泌基质金属蛋白酶;(2)浸润炎症细胞释放的炎症因子激活角膜上皮细胞和中性粒细胞的细胞内信号通路,上调基质金属蛋白酶的表达水平,刺激上述细胞分泌基质金属蛋白酶 然而,上述影响基质金属蛋白酶表达水平的推测机制是HSV-1是直接作用于角膜上皮细胞,还是HSV-1引起炎症细胞释放细胞因子,或者两者同时作用,但影响程度不同 同时,如何操作诱导基质金属蛋白酶分泌增加的机制需要深入探讨。 研究表明,基质金属蛋白酶的分泌可以通过激活几种细胞内信号通路来调节,包括黏着斑激酶通路[2]

粘着斑激酶(FAK)是一种重要的非受体蛋白酪氨酸激酶。它在细胞间及细胞与细胞外基质的粘附中起重要作用,同时与胚胎发育、周期调控、血管生成密切相关。FAK主要蛋白质结构由3个功能区域组成,即N端区、激酶区和C端区。其中激酶区为390~650位氨基酸残基区域,其氨基酸序列高度保守用以使相应蛋白质的酪氨酸残基磷酸化。在FAK中至少有6个酪氨酸磷酸化位点,其中Tyr397是最主要的自主磷酸化部位,在FAK分子间相互磷酸化和激活下游效应器的最大化中起到决定作用。未激活的FAK分子内N端区和C端区结构域相互连接,掩蔽了催化结构域和Tyr397位点。当FAK活化后构象发生变化,暴露催化结构域,同时Tyr397自身磷酸化,形成磷酸化粘着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phosphor-FAK)。应用western bloting 检测结果显示FAK Tyr397磷酸化蛋白表达显着增加。当FAK活化后构象发生变化,暴露催化结构域,同时自身磷酸化,形成磷酸化粘着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase, phosphor-FAK)。FAK活化后通过整合素等多条通路广泛参与多种细胞生物学过程[3]。研究发现[4-7],FAK蛋白被激活以后,可导致FAK-Src-p130Cas-Dock180信号复合物的形成并升高JNK( c-Jun NH2-terminal kinase)的激活水平从而刺激基质金属蛋白酶表达和活性的增加。 因此,我们认为角膜上皮的HSV-1感染可能通过病毒本身或释放细胞因子的炎性细胞激活FAK而促进角膜溃疡和坏死病变的形成,导致角膜组织中基质金属蛋白酶的分泌增加 为了进一步了解单纯疱疹病毒角膜溃疡的形成机制,采用免疫组织化学和分子生物学技术,研究了HSV-1直接诱导基质金属蛋白酶-2分泌与单纯疱疹病毒小鼠模型和体外培养的人角膜细胞系中FAK、FAK之间的关系。

第一部分基质金属蛋白酶基因在单纯疱疹性角膜炎中的表达

材料和方法

1。武汉市预防科学院动物实验中心提供的6-8周龄雌性BALB/c小鼠20只动物模型的建立,实验前双眼前段检查正常 将小鼠随机分为4组,每组5只。 第一、第二、第三和第四组分别为感染后0、2、7和14天。 通过乙醚吸入麻醉小鼠,并将每只小鼠的右眼作为实验眼。 显微镜下,交叉刮擦右眼角膜上皮后,将5 μ L (105个斑块形成单位PFU)单纯疱疹病毒滴在角膜上(病毒由武汉大学医学院提供),按摩眼球并停留20秒。 感染眼每天滴氯霉素滴眼液,裂隙灯下观察角膜病变。 各组小鼠分别在角膜感染后0、2、7、14天处死,取出角膜并保存在-80℃冰箱中

2。临床评估

角膜上皮和基质损伤的严重程度用0-4+评分 上皮损伤部分取决于上皮表面损伤区域的大小。 0:无上皮损伤;1+:上皮病变面积小于25%;2+:上皮病变面积小于50%;3+:上皮病变面积小于75%;4+:上皮病变面积为75%-100%[17]

3。组织病理学检查

角膜感染后,将4组角膜(20个角膜)固定在Mc-Dowells溶液中,即4%福尔马林、1%戊二醛、0.13%蔗糖、0.07mol/l氢氧化钠、0.08mol/l磷酸钠(PH 7.2)中6小时,随后进行一系列酒精脱水、石蜡包埋、5μm厚的组织切片并固定在APES处理的载玻片上,以及常规苏木精-伊红染色 角膜感染后0、2、7、14天观察角膜上皮缺损、基质溃疡形成、基质水肿、炎症细胞浸润和新生血管形成。

四。试剂和引物的合成三唑一步提取总核糖核酸。该试剂盒购自Iavitrogen公司,MMLV逆转录酶购自美国promega公司RNase Sin。dNTPM MIX由大连生物技术公司提供,TaqDNA聚合酶由Biostar公司提供,寡聚核苷酸18和引物由上海生物技术公司合成 基质金属蛋白酶-2引物设计参考[2],

上游为5,-GAGGGGCAGGCATACCT-3,

下游为5,-gccgtcctctccaagttgt-3,扩增片段为761bp;基质金属蛋白酶-9引物设计参考[3],

上游5,-agccctacagagtttg-3,

下游5,-cagtccaaaaaaaggacg-3,扩增片段894bp;

内部参考β-肌动蛋白引物设计参考[3],

上游为5,-gtgggccctctaggcaccaa-3,

下游为5,-ctcttttgatgtcacccgattc3,扩增片段为539bp

v. rt-pcr检测

1.三唑一步提取总核糖核酸:取一个冷冻角膜,在匀浆器中匀浆,加入0.8毫升三唑试剂,匀浆,加入200微升氯仿,振荡后离心,取上清液,加入等体积异丙醇混合均匀,离心,弃上清液,加入1毫升75%乙醇,离心后弃上清液,空空气干燥,加入无核酶水,58℃孵育10分钟。将所得核糖核酸溶于碳酸二乙烯酯DEPC中,用紫外分光光度计检测核糖核酸的纯度

2。反转录(25μl反应体系):取2μg核糖核酸,加入1μg寡聚脱氧核糖核酸和ddH2O,12μ l,70℃5分钟,冰浴5分钟 将M-MLV5×Buffer5μl、dNTP 5μl、200U/μl M-MLV逆转录酶1μl、40U/μl Rsin 0.7μl和ddH2O加入25μl,在42℃孵育90分钟

3。聚合酶链反应(25μl反应系统):在引物的上游和下游25pmol、2.5mm NTP 2.0μl、25mm mgcl2 1.5μ l、2.5μ l聚合酶缓冲液(10mm his-HCl ph 8.350 mkcl)和0.5μl Taq聚合酶中加入1μ l cdna 扩增条件为:β-肌动蛋白在94℃变性30秒,56℃复性30秒,72℃延伸45秒,共33个循环 基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9在94℃变性30秒,在53℃复性45秒,在72℃延长1分钟35个循环 取10μl扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,溴化乙锭染色,并在紫外光下观察。图像由计算机凝胶成像系统提取。通过比较基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9和β-肌动蛋白的密度值进行半定量分析。

6.实验仪器

1)聚合酶链反应仪(SLAN全自动荧光定量聚合酶链反应仪,型号(SLAN)中国洪诗公司,公司全称?)

2)离心机热电公司,型号labofuge400R

3)田丽医疗设备有限公司水浴箱:TL-420D

4)紫外透射仪型号3360WD-9403C

5)数码相机CAMON

6)琼脂糖凝胶电泳设备型号3360DYY-6C

7)引物设计应用引物5软件

8)聚合酶链反应仪应用AlphaEaseFC软件分析

6结节

FAK作为激酶广泛分布在组织中,通过多种复杂的信号通路调节发挥生物功能 FAK与细胞迁移密切相关,[21 J 有许多刺激因素影响内皮细胞FAK激活和内皮细胞迁移。整合素等细胞外成分可以通过FAK等诱导细胞骨架等发生变化,从而调节细胞迁移和细胞周期等细胞生物学行为 深入研究该途径有助于深入了解角膜溃疡等疾病的分子机制,为角膜炎的临床治疗提供新的途径。 随着对角膜炎分子机制的深入理解,将会发现一些新的整合素信号转导途径。 然而,这些刺激因子如何激活FAK,它们如何参与FAK上游和下游的信号分子以及FAK的磷酸化调节,它们最终如何影响粘附点和细胞迁移,以及它们如何以FAK为靶点来促进或抑制细胞迁移,这些问题仍然需要解决 对FA-K的进一步研究将为阐明细胞内信号通路和治疗各种疾病提供有力的帮助。

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