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miR-320a抑制结肠癌细胞增殖及肺转移作用的讨论

作者:临床医学
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-31

结肠癌是全世界人类主要的致命肿瘤疾病之一。它具有高致死性,预后差,并且肿瘤转移和复发是重要的死亡原因。目前,结肠癌的治疗主要是外科手术结合化学疗法和放射疗法,但最终肿瘤会复发和转移,因此生物学治疗可能成为结肠癌治疗的突破点。

MicroRNA是体内一类内源性非编码小核糖核酸,与靶基因的mRNA互补序列的3'-UTR结合,并通过降解和抑制靶基因的翻译来抑制靶基因的表达。多数研究发现,miRNA的异常表达通常会导致恶性疾病的发生和发展。最近的研究发现,miRNA介导的转录后调控可以调控结肠癌的发展。 2003年,Michael等人在大肠癌中发现了几种下调的miRNA,其中miR-320a具有活性。 Markowitz等人发现,miR-320a的表达在直肠癌中被下调,可用于直肠癌的早期诊断。标记之一。最近的一项临床研究报道,miR-320a表达的下调与II期结肠癌患者的肺转移不良和预后不良有关。但是,尚未深入研究miR-320a在结肠癌疾病进展中的作用机制。

在先前的研究中,我们发现与对照细胞GES细胞相比,miR-320a在SW480,HT29,HCT116细胞系和结肠癌组织中的表达水平降低,并且成功应用了慢稳定感染的结肠癌细胞构建稳定的表达。 miR-320a的结肠癌细胞。在这项研究中,我们进一步验证了其对体外细胞增殖以及细胞侵袭和转移的作用,验证了miR-320a的下游靶基因,并通过尾静脉注射试验在裸鼠中初步证实了其可能的肺转移程度。关系。

1材料与方法

1.1材料

结肠癌癌细胞系SW480,HCT116和293T细胞由癌症生物学国家重点实验室提供。 RPMI 1640培养基,DMEM培养基,胎牛血清购自Gibco; Lv-miR320a和Lv-Luc慢病毒质粒是由我们学校的生物化学部门捐赠的,MTT是从美国Sigma购买的; DMSO购自美国Sigma; Transwell室购自美国密理博; Matrigel Matrigel购自美国BD; BALB/C裸鼠购买了自校准实验动物中心;双重荧光素酶报告载体pGL3-对照载体和内部参考质粒pRL-TK购自Promega; miR -320a模拟物,NC对照,PLKO-β-catenin质粒和PLKO-EGFP对照质粒购自上海吉马公司; Dual-Luciferase Reporter 1000分析系统购自ABI公司,β-肌动蛋白,β-连环蛋白,MMP-2,MMP-9,Ecadherin,N-cadherin和Vimentin抗体购自美国圣克鲁斯。

1.2方法

1.2.1细胞培养和感染,转染的培养细胞(SW480和HCT116)持续48h,更换新鲜培养基,并用终浓度为8μg/ml的Lv-miR320a和Lv-Luc病毒溶液感染细胞。筛选4周后,获得稳定表达miR-320a的SW480和HCT116结肠癌细胞亚系和表达阴性对照Lv-Luc的细胞亚系。在含有10%胎牛血清和双重抗体的RPMI1640培养基中,于37°C,5%CO 2培养箱中培养结肠癌细胞系。用Lipofectamine 2000转染MiR-320a mimics/NC和pGL3-β-catenin3'UTR /pGL3-mut-β-catenin3'UTR和pRL-TK参考质粒,PLKO-β-catenin质粒和PLKOEGFP对照质粒说明。结肠癌细胞系。

1.2.2 MTT实验

将每组细胞制成1×10 4个细胞/ml的单细胞悬液,并以每孔200μl接种到96孔板中,干预2、3后,为每个细胞设置6个重复孔,分别为4天,5天和6天。在黑暗中添加20μlMTT溶液(5mg/ml),在37°C的培养箱中孵育4h,弃去上清液,加入150μlDMSO,振摇10min,并在490nm波长处测定每个孔的吸光度酶联免疫吸附测定。值。

1.2.3细胞入侵实验

Matrigel Matrigel在冰上融化后,用RPMI1640培养基稀释,将100μL加入到TrimWELL室的上腔中,在37℃下孵育4小时,以固化MatRIGL凝胶。大肠癌细胞组干预48h后,用胰蛋白酶消化,其中1个细胞在含%fbs的rpmi1640培养基中再悬浮,200μl细胞在1×105细胞/ml浓度下接种,600μl含20%fbs的rpmi1640培养基加入。下腔。在37°C,5%二氧化碳培养箱中孵育24小时后,用棉签轻轻擦拭过滤器上表面的细胞,用4%多聚甲醛固定,用0.1%结晶紫染色,用PBS清洗。在高功率场中计数细胞数,从每个腔室中随机抽取5个视场,记录每个视场的细胞数。以计数跨膜细胞的数量,间接反映肿瘤细胞的侵袭能力。

1.2.4β-catenin 3′utr荧光报告基因的构建

pcr扩增β-catenin的3'utr,克隆到pmd-18t载体上测序,再亚克隆到pgl3对照载体上,得到β-catenin wt-utr载体。产物β-连环蛋白mut-utr载体是一种点突变替代物,可以通过pcr进行表达。

1.2.5双荧光素酶报告基因分析

293T细胞在48孔板上的含10%FBS的DMEM中培养,当生长至80%至90%时,合成的miR-320a模拟物/NC和pGL3-β-catenin3'UTR/pGL3-mut-β- catenin 3'UTR和pRL-TK参考质粒与Lipofectamine共转染到293T细胞中。转染48小时后,使用Dual-Luciferase Reporter 1000分析系统分析萤火虫和海肾的荧光强度。

1.2.6 Western Blot实验

用PBS清洗经小组干预处理48小时的结肠癌细胞,将400μlRIPA裂解液添加到每个瓶中,吹扫,在冰上裂解,收集到离心管中,以 r/min的速度离心,收集上清液,并在100°C下加入上样缓冲液。蛋白质在20 min变性,每孔上样10μl,然后在SDS-PAGE上电泳,转移至PVDF膜上,封闭5%脱脂乳将第一抗体在4°C下孵育过夜,洗涤PBST,将第二抗体孵育2 h。洗涤膜并通过化学发光检测。暗室压缩暴露。

1.2.7动物实验

裸鼠为7-8周大,体重(20±2)g,雌性为24只。将miR-320a在对数生长期的稳定表达和表达阴性对照Lv-Luc的SW480结肠癌细胞亚群重悬于PBS中。将细胞浓度调节至5×103/ml,并通过尾静脉注射将细胞注射入裸鼠。观察裸鼠的肺的肺表面中大于0.5mm的转移的数目,并取出裸鼠的肺组织用于HE染色。

1.2.8基因拯救实验

将构建的3’utr结合位点突变β连环蛋白表达质粒(plko-beta-catenin)和对照组(plko-egfp)分别转染到稳定表达microrna-320a的大肠癌细胞株中。裸鼠尾静脉按1.2.7试验方法注射。观察裸鼠肺转移瘤的数目和大小,并对裸鼠肺组织进行he染色。

1.3统计处理

所有数据均来自三个具有重复性的独立实验。以上实验数据用spss13.0统计软件进行分析。实验数据用平均值(标准差)表示。采用单因素方差分析和配对t检验分析各组间差异。p<;0.05为显著性差异。

2个结果

2.1 microRNA-320A抑制结肠癌

为了研究microrna-320a对细胞生长的影响,我们用慢病毒稳定感染结肠癌细胞株sw480和hct116,增加microrna-320a的表达,并检测细胞存活率的变化。mtt结果显示,与对照组相比,mir-320a过度表达的sw480细胞在第5天的生长明显受到抑制。od值分别为0.28(+0.03)和0.37(+0.04)(p<;0.05)。与对照组相比,mir-320a高表达的hcct116细胞在第4天的生长明显受到抑制,od值分别为0.31(+0.02)和0.47(+0.05)。03(p<;0.05)。mtt法检测结肠癌细胞株sw480和hct116的增殖率明显低于对照组(图1)。

2.2 mi-320a抑制结肠癌细胞侵袭

通过上调microrna-320a在结肠癌细胞中的表达,发现结肠癌细胞株sw48 0和hct116的侵袭能力明显低于对照组。上调sw480细胞microrna-320a的表达后,通过基底膜的细胞数分别为108.67(+17.25)和211.67(+31.93)(p<;0.05)。hct116细胞上调microrna-320a的表达,与上调前相比,通过基底膜的细胞数分别为98+15.25和210.33+26.64(p<;0.05)。可见,与对照组相比,microrna-320a抑制了结肠癌细胞的侵袭(图2)。

2.3在结肠癌细胞中,β连环蛋白是microrna-320a。

根据基于microrna预测软件对直接靶基因的预测分析,我们发现β连环蛋白的3’utr含有microrna-320a的结合位点(图3a)。为了确认microrna-320a是否与β-catenin 3'utr结合,我们使用双荧光素酶报告基因系统在293t细胞中验证了它。结果表明,转染的pgl3β-连环蛋白3'utr的荧光强度降低了40%,但pgl3-mutβ-连环蛋白3'utr的荧光强度没有明显变化(图3b),表明microrna-320a直接与该结构结合。western blot分析证实内源性β连环蛋白在高表达microrna-320a的结直肠癌细胞中的表达在蛋白质水平上显著降低(图4)。这些结果提示β连环蛋白是microrna-320a在结肠癌中的直接靶基因。

2.4 mir-320a调节结肠癌细胞的emt和侵袭相关碱基

western blot分析显示e-cadherin表达上调,而n-cadherin、vimentin、mmp-2和mmp-9表达下调(图5)。

2.5 microrna-320a对结肠癌肺转移的抑制作用

尾静脉注射20d后,计数裸鼠双肺转移结节数。lovo-lv-luc组平均肺转移结节数为(46.67+13.47),lovo-lv-micro320a组平均肺转移结节数为(12.92+4.57)。差异有统计学意义(p<;0.05)(图6a)。he染色后,我们发现lovo-lv-luc组裸鼠肺中有明显的肺转移,而lovo-lv-mi320a组裸鼠肺中仅克隆到小的肺转移(图7a,b)。提示microrna-320a对结肠癌细胞的肺转移有一定的抑制作用。此外,与对照组(plkoegfp)相比,β连环蛋白表达恢复后,microrna-320a对肺转移的抑制作用明显减轻。plko-egfp组肺转移结节平均数为(12.33+5.61),plkoβ-catenin组为(12.33+5.61)。(51.50+18.10,差异有统计学意义(p<;0.05)(图6b)。he染色显示,plko-beta-catenin组裸鼠双侧肺转移灶数目较对照组明显增多。

3讨论

在过去的二十年中,越来越多的研究表明,miRNA在肿瘤的发展中起着重要的作用。最近的研究表明,某些miRNA在细胞转化和肿瘤发生中起重要作用。体外和体内的功能测试已直接证明了某些miRNA的致瘤和抗肿瘤特性。研究发现,miR-320a在结肠癌患者的血清中表达低,可作为结肠癌诊断和预后的标志物。另一项研究报道,预后良好的II期大肠癌患者的miR-320a表达水平较高,但没有功能支持研究。在我们先前的研究中,我们发现miR-320a在结肠癌组织和结肠癌细胞中的低表达。在这项研究中,我们发现miR-320a表达水平的上调可以抑制结肠癌细胞的增殖,侵袭和转移,并证明miR- 320a的抗肿瘤作用。

先前的研究表明mir-320a在胆管癌中表达不足。mir-320a的过表达可通过抑制抗凋亡分子bcl-2直接抑制肿瘤细胞凋亡。mir-320a在乳腺癌中的表达也很低。抑制靶基因rab11a,从而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移,mir-320a甚至可能成为乳腺癌预后的潜在标志物。在对鼻咽癌的研究中,mir-320a在鼻咽癌组织和细胞系中表达不足,并通过靶向癌基因bmi-1抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。此外,mir-320a在恶性胶质瘤中表达下调,靶向抑制igf-1r的表达,通过调节pi3k/akt和mapk/erk途径抑制恶性胶质瘤细胞的增殖、侵袭和转移。膀胱癌也有类似的作用。我们的研究还发现mir-320a可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。一项研究表明mir-320家族在结肠癌干细胞中的表达水平降低,提示mir-320可能促进结肠癌细胞的分化。大量证据表明β-catenin在结肠癌细胞中保持着积聚,并可能抑制结肠癌干细胞的自我更新。本研究证实β-catenin是mir-320a在结肠癌细胞中的直接靶基因,mir-320a通过抑制β-catenin的表达进一步影响结肠癌细胞的生物学行为。在白血病研究中,mir-320a通过靶向抑制bcr/abl,促进慢性粒细胞白血病肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖,阻断emt过程,抑制肿瘤细胞侵袭转移。同样,我们发现mir-320a抑制结肠癌细胞emt相关基因的表达,抑制结肠癌细胞的侵袭和转移。在裸鼠中进行的体内实验表明,miR-320a对结肠癌中肺转移的形成具有显着的抑制作用,并且在唾液腺样囊性癌的肺转移中也有类似的作用。此外,也已经报道了miR-320a对结肠癌肝转移的抑制作用,其内在机制值得进一步研究。

结肠癌的发展是一个复杂的过程。 Wnt /β-catenin信号通路在结直肠癌的发展中起着核心作用。大量证据表明,Wnt /β-catenin途径可促进结肠腺瘤和癌中肿瘤细胞的增殖。在结肠癌中,Wnt /β-catenin信号传导通路总是被突变,并且经常作用于抑癌基因APC,Axin2或癌基因β-catenin。 Wnt信号通路首先形成Tcf /β-catenin复合物,然后进一步转录丢失对靶基因(如c-myc,CCND1和survivin)的控制。与结肠癌不同,尽管Wnt /β-catenin信号通路是肝癌和胃癌发展的主要原因,但APC基因突变的发生频率较低,而β-catenin仅在不到30%的肿瘤中发生突变[29,30]。因此,Wnt /β-catenin可能具有结肠癌变异的其他机制。一项研究报告了一种称为QKI的RNA结合蛋白,该蛋白与结肠癌细胞中的3'UTR直接结合并抑制β-catenin的转录,这表明转录后调控可能是调控β-catenin的关键。在本研究中,我们证明了转录后水平上miR-320a对β-catenin的负调控。上调miR-320a的表达后,肿瘤侵袭和肺转移的能力降低,表明miR-320a可以抑制结肠癌细胞的侵袭和转移,从而验证miR-320a是否通过抑制miR-320a来调节肿瘤细胞。目标基因β-catenin。转移后,我们进行了基因拯救实验。在miR-320a高表达的结肠癌细胞中,我们添加了具有3'UTR结合位点突变的β-catenin表达质粒。实验结果表明,与对照组相比,β表达上调。 -catenin表达后,可以阻断miR-320a对结肠癌细胞的侵袭和转移的作用,表明miR-320a通过抑制其靶基因β-catenin抑制结肠癌细胞的侵袭和转移。在其他研究中,在其他肿瘤中,miRNA(例如miR-200a,miR-1826和miR-483-3p)直接与β-catenin的3'UTR结合,从而抑制了其表达。这表明microRNA介导的转录后沉默机制在调节肿瘤细胞中β-catenin的表达水平中起决定性作用。此外,我们的实验还观察到miR-320a还抑制结肠癌细胞的EMT过程,这也可能与抑制β-catenin并因此激活相关途径有关,但还需要进一步研究其内在机制。

总之,这项研究证实了mir-320a抑制结肠癌细胞的增殖,侵袭和转移,而抑制癌症的机制是通过抑制靶基因β-catenin。我们已经证实了miRNA-320a在结肠肿瘤发生和发展中的部分机制。由于microRNA-320a的抗癌作用,它可能通过抑制靶基因的表达在癌症治疗中发挥治疗作用。尽管基于microRNA的治疗仍处于起步阶段,但我们的结果表明,microRNAs-320a可能成为结肠癌治疗的潜在靶标。

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