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上调人1型大麻素受体表达诱导人宫颈癌细胞凋亡的实验讨论

作者:毕业论文
出处:www.lunrr.com
时间:2019-11-04

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,占女性生殖系统恶性肿瘤的一半以上,其死亡率在女性恶性肿瘤中居首位。近年来,随着人类乳头瘤病毒(HPV)感染率的增加,宫颈癌的发病率呈上升趋势,患病年龄趋于年轻化,已成为严重危害妇女健康的主要疾病之一。当前的常见治疗方法是放射疗法,化学疗法或外科手术,但是据报道,这些治疗方法可能存在诸如预后不良,肿瘤复发等问题,并且这些问题在临床上仍是无法解决的问题。为了找到更多更好的方法来治疗该疾病并降低治疗成本,国内外学者正在研究各种靶向治疗方法。大麻素受体有两种类型:大麻素受体1(CB1R)和大麻素受体2(CB2R)。研究表明,大麻素对癌细胞具有生长抑制作用,但是尚未完全证实大麻素受体可以抑制宫颈癌细胞的生长。本研究构建了hCB1R真核表达载体以确定其在HeLa细胞中的表达,并研究了hCB1R对宫颈癌细胞凋亡及其作用机制的研究,为大麻系统在肿瘤中的应用奠定了一定的实验基础。治疗。

1材料与方法

1.1一般信息

人脑组织cDNA,HEK293细胞,宫颈癌He-La细胞和GV230质粒已保存在我们的实验室中。总RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒购自Promega; T-vector连接试剂盒,T4 DNA连接酶,DH5α细菌凝胶回收试剂盒,实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自Takara; XhoI和KpnI酶购自NEB;质粒提取试剂盒购自Qiagen; LipofectamineTM 2000购自Invitrogen;兔源CB1R抗体,兔源Bcl-2抗体,兔源Bax抗体,兔源Bad抗体购自Abgent;兔来源的GAPDH抗体购自Bioword; HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中商金桥有限公司。山羊抗兔IgG购自Abbkine; 4',6-二mid基-2-苯基吲哚(DAPI)和抗荧光猝灭剂购自碧云田;流式细胞仪购自Coulter; GeneGnome5化学试剂发光成像仪购自Syngene。 iQ5 qRT-PCR仪器购自Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1 hCB1R引物的设计与合成

根据Genban N.4基因序列号,使用Primer Premier 5.0软件设计引物。将XhoI限制性位点添加到上游引物的5',并将KpnI限制性位点添加到下游引物5'。该引物由上海英杰生命技术有限公司合成。 hCB1R,Bcl-2,Bax,Bad和GAPDH的上游和下游引物序列如表1所示。1.2.2 hCB1RPCR的扩增和产物纯化人类cDNA被用作基因模板来扩增hCB1R编码序列(CDS)区域片段。 PCR反应条件:50μL系统;在94℃下预变性5分钟;在94℃变性30s,在55℃退火30s,在72℃延伸2min,30个循环; 72°C延伸10分钟。 PCR产物在120g/L琼脂糖凝胶上电泳,并如凝胶回收试剂盒中所述回收纯化的片段。

1.2.3 hCB1R真核表达载体的构建与鉴定

用XhoI和KpnI酶消化hCB1RPCR纯化的产物和真核载体质粒GV230,并回收和纯化消化的产物。按照T4 DNA连接酶试剂盒连接,将产物连接至DH5α感受态细胞,接种于含卡那霉素的LB培养基平板上,筛选阳性克隆,然后接种至含卡那霉素,细菌液的LB液体培养基中。试剂盒,并用XhoI和KpnI消化质粒,然后送至Shanghai Invitrogen进行测序。

1.2.4检测HeLa细胞中hCB1R的表达和定位

将He-La细胞接种到DMEM培养基中的含有100 mL/L胎牛血清的35 mm培养皿中,在37°C,50 mL/L CO2中培养过夜,细胞融合度为50%至70%,并设置hCB1R组和空。根据LipofectamineTM2000转染说明将质粒组转染到GV230-hCB1R和GV230中。 48小时后,收获细胞并超声处理以获得蛋白质。将蛋白质样品在100°C下变性10分钟,加载5μL蛋白质样品,进行100 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并用含5 g/L的TBST封闭膜脱脂牛奶2.0小时。兔抗CB1抗体(1:500)在4°C下孵育过夜,而辣根过氧化物(HRP)标记的山羊抗兔IgG在室温下孵育2.0 h,并通过化学发光(ECL)显影。将质粒HeLa细胞转染48.0h后,吸出上清液,并用1mL冰甲醇固定20min。室温下30mL/L H2O2持续20min; 50mL/L的胎牛血清封闭1.5h;兔抗CB1R抗体(1:100)在4°C孵育。过夜,将红色荧光标记的山羊抗兔IgG(1:50)在37°C下孵育2.0 h,DAPI染色5分钟,安装抗荧光淬灭剂,并通过激光共聚焦扫描检测荧光。

1.2.5检测hCB1R和凋亡相关因子蛋白的表达

hCB1R组和空白组分别是抗兔源CB1R(1:500),兔源Bcl-2(1:1 000),兔源Bax(1:1 000),兔源Bad(1:1 000)一抗在4°C,HRP标记的山羊抗兔IgG(1:1 kg)下孵育过夜,在室温下孵育2 h,并通过ECL方法显影。

1.2.6检测hCB1R及凋亡相关因子的mRNA表达

采集cb1r细胞和空白细胞,用rna提取试剂盒和rna反转录试剂盒进行dna提取。根据qrt-pcr试剂盒的指示,在25-mu-l反应体系中进行操作。pcr反应条件为95~c,10min;94~c,20s,60~c,30s,72~c,30s,40个周期。实验数据用2-delta-ct分析,用rq实验组=2-delta-ct和rq对照组=1计算delta-ct=(ct靶基因ct内参照)空白组的相对定量(rq)。

1.3统计处理

统计分析采用spss17.0统计软件,测量数据采用t检验,统计分析采用p<;0.05。

2个结果

2.1 PCR扩增的HCB1R PCR产物电泳结果显示,靶带出现在1500 bp处,与预期结果一致。

3讨论

cb1r分布于大脑、生殖系统等,cb2r存在于免疫系统中,均为7倍的跨膜g蛋白受体,同源性为68%。大麻素是大麻植物的有效成分。大麻素具有镇痛、镇静、抗痉挛、抗呕吐等药理作用,具有明显的抗肿瘤活性。大麻素对皮肤癌、乳腺癌、胶质瘤等具有抗肿瘤作用。内源性(如2-ag和anandamide)、天然(如四氢大麻酚、thc)和合成(如氨基烷基吲哚大麻衍生物win55、212-2、win)三种。目前的研究发现大麻素通过刺激大麻素受体下调组织中基质金属蛋白酶-1的表达,选择性地抑制癌细胞的恶性增殖,对乳腺癌有显著的抑制作用。前列腺癌和胰腺癌。

此外,国内外的临床前实验发现,CB1R除具有减轻疼痛和恶心,改善情绪和刺激食欲的生物学作用外,还具有预防癌症的功能。 CB1R在人类直肠癌中起着抑癌基因的作用。它通过甲基化基因启动子减弱直肠CB1R受体的表达,从而加速肿瘤细胞的生长。相反,CB1R受体的激活调节依赖cAMP的PKA信号通路并下调抗性。死亡因子的存活率诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明,CB1R/2R在肝癌细胞中高表达,并且在体外和体内实验中都证实δ9-THC对HepG2/BEL-7402细胞具有抑制作用。在小鼠模型中,内源性大麻素AEA可以减少结肠异常灶的形成,并且在结肠癌CaCo-2细胞中均表达CB1R和CB2R受体,并且CB1R的表达远高于CB2R。 AA可以通过CB1R受体和脂质筏抑制结肠癌CaCo-2细胞中p-AKT蛋白和caspase-3信号分子的表达,抑制增殖并促进细胞凋亡,而CB1R受体抑制剂SR1A可以部分拮抗它。抑制作用。大多数信号传导途径(例如p38MAPK,PI3K,ERK)的激活均调节凋亡级联Bcl-2/Bcl-xL或Bad蛋白影响细胞凋亡,并主要通过两种途径调节细胞凋亡:一种是细胞表面Fas介导的细胞凋亡的死亡。第二个是线粒体信号系统,例如Bcl-2家族。 Bcl-2家族是最广泛和最广泛的凋亡调节基因,并且通常被分类为抗凋亡基因和促凋亡基因。其中,抗凋亡基因包括Bcl-2,Mcl等,促凋亡基因包括Bax,Bad等。 Bcl-2基因产物抑制细胞色素C的释放,从而发挥抗凋亡潜能。

宫颈癌治疗药物及其作用机制的研究与开发一直是宫颈癌研究的热点。本实验首先构建hcb1r真核表达载体,转染hela细胞,检测hcb1r在细胞中的表达。检测hela细胞bax、bad和bcl-2的mrna和蛋白表达。结果表明,hcb1r组促凋亡因子bad和bax的表达水平高于空白组,但具有抗凋亡作用。bcl-2因子表达水平低于空白组,说明hcb1r上调bax和bad的表达,下调bcl-2的表达,促进hela细胞凋亡。实验表明,hcb1r可通过激活不同的信号通路和调节凋亡相关蛋白的表达而诱导细胞凋亡。

本研究成功构建了gv230-hcb1r质粒,为进一步研究hcb1r的生物学活性提供了载体基础。为肿瘤的基因治疗和机制研究提供实验依据。基础。大麻素系统在宫颈癌的发生发展中起着重要作用,在介导细胞增殖和凋亡中起着重要作用,有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

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