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HIV-1Rev蛋白和人DDX3解旋酶对HCVRNA复制产生的作用研究

作者:旅游论文
出处:www.lunrr.com
时间:2019-11-07

丙型肝炎病毒(hcv)和人类免疫缺陷病毒(hiv)的传播途径非常相似,约30%的hiv阳性患者有hcv感染。在我国静脉吸毒的hiv感染者中,hcv阳性率可高达90%。hcv患者感染hiv会加速丙型肝炎的进展,降低抗hcv的疗效。近年来,越来越多的研究表明,对合并感染的患者进行抗hiv的高效抗逆转录病毒疗法(haart)不能有效改善这些状况,hcv病程的加快与cd4+t淋巴细胞数量的减少也无显著相关性。我们以前的研究也证实hiv共感染可能导致hcv准种在患者体内分布的改变,但hcv载量和准种复杂度与cd4+t淋巴细胞数量无关。以上证据表明,hiv对hcv的影响可能有其他途径。研究表明,hcv和hiv可以共同感染同一肝细胞,这可能导致两种病毒在同一肝细胞内的相互作用。hcv和hiv都是rna病毒,ddx3与人类细胞rna复制过程密切相关。已证实ddx3能与hcvcore蛋白结合促进hcv复制。同时发现hiv-1rev蛋白能在核膜上与ddx3形成复合物,导致胞质中ddx3水平下降。还表明rev蛋白在hcv5'-utr的作用下能直接促进hcv的复制。然而,没有研究证实rev蛋白可以通过间接作用影响hcv的复制,或者通过影响其他细胞代谢途径影响hcv的复制,也没有研究证实rev蛋白和ddx3可以协同作用影响hcv的复制。

本研究通过构建分别表达DDX3和Rev + DDX3的HCV RNA复制细胞模型和HCV RNA复制细胞模型,研究了Rev蛋白和DDX3对HCV RNA复制的影响。目的是进一步研究Rev蛋白和DDX3是否协同作用以影响HCV RNA复制。

1材料与方法

1.1材料

Huh7肝癌细胞系和HCV复制模型pCDNA3.1-JFH1保存在该实验室中。 Huh7细胞系在10%灭活的小牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,氨苄西林(100U/mL)和链中生长。将细胞在37℃,5%CO 2的培养基(100U/mL)和DMEM培养基中培养。实验的主要材料包括:真核过表达质粒pCDNA3.1(北京定果生物技术有限公司),各种工具酶,核酸标准分子量标记和蛋白预染标记(天健生化有限公司)。北京),去内毒素质粒大规模提取试剂盒(德国,恰根),质粒转染试剂Lipofectamine2000(美国,Invitrogen),小鼠抗-Flag单克隆抗体(美国,Sigma),兔抗人GAPDH单克隆抗体,小小鼠抗-人DDX3单克隆抗体,小鼠抗HIVRev单克隆抗体(Abcam,美国),HRP标记的山羊抗兔IgG二抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗(中国福州麦新公司) Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1含rev和ddx3基因的重组真核表达载体的构建通过ncbi获得rev蛋白和ddx3的基因表达序列,并在基因的5'端引入限制性内切酶位点ecori和增强表达kozak序列。3’端引入了限制性内切酶xbai位点和标记蛋白(dykddddk)编码序列,有助于检测rev和ddx3的表达,以及mcherry和yfp序列,有助于观察转染效率。以上相关基因序列由深圳华大生物科技有限公司合成,分别插入真核过表达载体pcdna3.1中,命名为pcdna3.1-rev-flag-mcherry和pcdna3.1-ddx3-yfp-flag。从genbank中搜索目的基因和上下游序列,利用vectornti软件进行pcr引物设计。载体pcdna3.1-rev-flag-mcherry正向引物(5'-agtccaggtggtggaattcccacagagccagagtagtctag-3’)(含同源重组序列、Ecori裂解位点、Kozak序列和感兴趣基因的5'端对序列)。5'-tagtccatgggcgaattcttttagttcctgactccatac-3')(含同源重组序列、ecori限制位点,含感兴趣基因的3'端配对序列)。载体pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag正向引物5'-ACGATGACGATAAGCTCGAGGCCACCATGAGTCATGTGGCAGTGG-3'(包含同源重组序列,XhoI限制性酶切位点,Kozak序列,并包含目标基因的5'末端配对序列),反向引物5' -GTTTAAACGGGCCCTCTAGATCAGTTACCCCACCAGTCAAC-3'(包含同源重组序列,XbaI限制性酶切位点,并包含目标基因的3'末端配对序列)。

1.2.2重组pcDNA3.1-rev-flag-mcherry、pcDNA3.1-ddx3-yfp-flag质粒的鉴定重组pcDNA3.1-rev-flag-mcherry、pcDNA3.1-ddx3-yfpflag质粒转化大肠杆菌dh5α,均匀涂在含氨苄西林的琼脂糖平板上,第二天扩增阳性的单克隆菌落,然后提取质粒进行PCR扩增并进行琼脂糖凝胶电泳。将扩增产物回收并进行核酸测序。

1.2.3重组pcDNA3.1-rev-flag-mcherry、pcDNA3.1-ddx3-yfp-flag和pcDNA3.1-jfh1质粒用脂质体2000转染剂转染,按说明书进行实验。分别将重组pcdna3.1-rev-flagmcherry和pcdna3.1-ddx3-yfp-flag质粒瞬时转染huh7细胞,荧光显微镜观察转染效率。将pcdna3.1-jfh1瞬时转染huh7细胞,用qpcr检测hcv的复制。

1.2.4用蛋白质印迹法检测Rev和DDX3基因在Huh7细胞中的表达。转染48小时后,提取总蛋白并进行SDS-PAGE电泳。电穿孔在4℃在300mA的恒定电流下进行120分钟。在室温下,用封闭溶液(含5%脱脂奶的TBST)封闭PVDF膜1小时,并用TBST洗涤膜3次,每次10分钟,并以1的比例添加一抗:5000。将抗Rev单克隆抗体在4°C下孵育过夜,将TBST洗涤3次,每次10分钟,然后将第二种抗体加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体的1:5000稀释液中2小时在室温下,洗涤TBST。 3次,每次10分钟。以GAPDH作为内部参考的化学发光试剂检测。

1.2.5用Lipofectamine2000转染试剂进行qPCR检测细胞内Rev,DDX3对HCV复制的影响,根据使用说明进行实验。将pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1瞬时共转染到Huh7细胞中,并使用qPCR检测HCV复制。将pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry,pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1瞬时共转染到Huh7细胞中,并使用qPCR检测HCV复制。搜索NCBI中的HCV基因组序列,并以5'非翻译区为模板设计引物。引物序列为HCV-F: 5'-CCCTGTGAGGAACTACTGTCTT-3'; HCV-R: 5'-TGAGCGGGTTTATCCAAG-3'。引物序列由美国Invitrogen合成。扩增条件为在95°C下预变性1分钟,在95°C变性10s,在58°C退火30s,循环40次,最后添加65-95°C的溶出曲线。标准曲线:取1μgPCDNA3.1-JFH1并以10倍梯度稀释5个梯度,并根据上述系统进行实时PCR检测。最后,将每个梯度的Ct值带入相应的最终浓度计算函数,最后通过该函数计算每个函数。样品中HCV复制的相应水平。

1.3统计处理

使用SPSS 17.0进行统计分析。实验组和对照组分别通过两个独立的样本进行t检验,以确定是否存在显着差异。

2个结果

2.1使用重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag真核表达载体鉴定含有pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherryg质粒的质粒。纯化后,纯化质粒并通过PCR鉴定。通过5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物,并在400bp附近定位1个特异性条带。核酸测序的结果表明,克隆的外源基因的总长度为394 bp。扩增并培养含有pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒的质粒。然后纯化质粒并通过PCR鉴定。通过5%琼脂糖凝胶电泳分析产物。有两个特定的带,分别位于2000bp附近。核酸测序的结果表明,克隆的外源基因的总长度为2035 bp。通过对克隆的外源基因序列进行测序,并将其与GenBank中的Rev和DDX3序列进行比较,证实了该基因序列的100%同源性,表明成功构建了Rev和DDX3的真核表达载体。

将2.2Rev和DDX3基因在Huh7细胞中的表达以及重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒的表达分别转染到Huh7细胞中。转染24小时后,使用荧光显微镜观察荧光。 Rev在荧光显微镜下发光,DX3在荧光显微镜下发黄。转染48小时后提取总蛋白。 Westernblot检测Rev蛋白和DDX3的表达。凝胶成像结果表明,重组pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag质粒可以在Huh7细胞中表达相应的蛋白。

2。3d-dx3对pcdna3.1-ddx3-yfp-flag和pcdna3.1-jfh1质粒共转染huh-7细胞hcv复制的影响。48小时后用trizol法提取总rna。qpcr检测hcv复制水平。对照组和实验组两个独立样本进行t检验。结果表明,转染ddx3和hcv复制质粒后,hcv的复制水平明显高于单独转染ddx3和hcv复制质粒(4.79×106+1.24×106)后的复制水平(1.09×107+0.18×107)(p=0.03)。这些结果提示ddx3能增强hcv在细胞内的复制。

2.4rev和ddx3对pcdna3.1-rev-flag-mcherry、pcdna3.1-dx3-yfp-flag和pcdna3.1-jfh1质粒共转染huh-7细胞hcv复制的影响。转染后48h提取总rna,qpcr检测hcv复制水平。对照组和实验组两个独立样本进行t检验。结果表明,将rev、ddx3和hcv复制质粒共转染huh-7细胞后,hcv的复制水平(1.74×107+0.40×107)明显低于单纯hcv的复制水平(4.17×107+0.46×107)(p<;0.001)。rev蛋白与ddx3联合应用可抑制hcv复制。

3讨论

研究表明,循环血液中的HIVgp120蛋白在与肝细胞表面的CCR5和CXCR4接触后,可以激活肝细胞中TGFβ-1的表达,从而促进HCV在肝细胞中的复制。研究发现,可以从CD4-CXCR4 +的原代肝细胞中成功分离出HIV。 Fromentin证实CD4-CXCR4-的某些肝癌细胞系也可以感染HIV。事实证明,HIV和HCV可以共同感染相同的肝细胞,表明它们具有直接作用。在HCV合并感染的HIV患者中,HIV可以促进HCV复制并加速肝纤维化的进程。与HIV感染的患者和HIV感染的患者相比,肝相关疾病是非艾滋病死亡的主要原因。最近的研究表明,HIV和HCV共同感染会加速疾病的发展,尤其是HIV感染,这会增加HCV复制,肝细胞凋亡,肠道微生物易位以及损害HCV的特异性免疫反应。 HIV和HCV患者分别进行了HIV抗病毒治疗和HCV抗病毒治疗。结果表明,抗病毒治疗有效地延迟了HIV和HCV感染患者的肝纤维化进程并减少了晚期肝病的并发症。但是,接受常规PEG-IFN加利巴韦林治疗的HIV感染的HCV患者的持续病毒学应答明显低于单纯HCV患者。

研究表明,Rev蛋白在HIV-1的发病机理中起着重要作用,它可以促进HIV-1病毒颗粒的产生并抑制该病毒所有调节蛋白的产生。由于HIV和HCV在细胞复制中不能自行合成RNA解旋酶,因此它们在细胞中的复制需要细胞内RNA解旋酶的参与。 DDX3属于DEAD解旋酶家族,DDX3参与多种细胞过程,包括mRNA的剪接和转录,翻译的起始和RNA的运输。研究表明,DDX3可以与HIV-1中的Tat蛋白相互作用,刺激病毒mRNA的翻译,并与Rev蛋白相互作用,从而参与REV-RRE介导的输出。研究表明,DDX3与HCVCore蛋白结合以促进HCV复制。同时,一些学者发现HIV-1Rev蛋白可以与DDX3在核膜上形成复合物,从而影响细胞质中DDX3的水平。还已经发现,Rev蛋白可以通过HCV 5'-UTR的作用直接促进HCV的复制。但是,尚无研究证实Rev可以通过间接作用影响HCV的复制,也没有研究证实Rev蛋白和DDX3对HCV的作用。

这项研究证实,pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry,pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag可以在真核细胞中表达。转染后48hq PCR检测表明,单独的DDX3与HCV相互作用时可促进HCV RNA复制。当Rev和DDX3共同作用于HCV时,它可以有效抑制HCV RNA的复制。可能的原因: 1Rev和DDX3结合在细胞中形成复合物,从而降低了细胞中DDX3的水平,减少了DDX3向HCV RNA的复制,并竞争性地抑制了DDX3对HCV复制的作用; 2也可能抑制某些信号转导途径,从而影响HCV RNA的复制,因为Rev和DDX3不仅在HCV表达中起作用,而且还参与细胞中的多个信号转导途径。 Rev和DDX3的组合也抑制相应的信号传导途径,从而导致HCV RNA的表达。数量减少; 3或改变Rev和DDX3在细胞中的分布,导致它们无法在指定的作用位点与HCV相互作用,从而导致HCV RNA表达量减少。

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