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二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达带来的影响

作者:建筑工程
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-16

超过5%的糖尿病患者死于心血管疾病。糖尿病可引起多种并发症,例如心肌梗塞,糖尿病性心肌病,糖尿病性肾病。因此,严格控制血糖对糖尿病患者尤为重要。

心肌细胞盘上有一个缝隙连接(GJ)通道,该通道由连接蛋白(Cx)组成。它是心肌细胞电信号和化学信号之间的耦合通道。它不仅可以在细胞之间交换离子和ATP之类的物质,而且还可以传导电信号以实现心肌细胞的同步弛豫和弛豫,并完成抽血过程。连接蛋白43(CX43)主要存在于心室肌细胞中。研究表明,Cx43的异常表达或分布与许多疾病有关,如心律不齐,高血压,动脉粥样硬化等。研究发现高血糖下Cx43的表达降低,分布异常,心律失常的发生率增加。这些证据表明,Cx43在维持正常心脏功能中起着至关重要的作用。

二甲双胍是最常用的口服降糖药,被广泛用于治疗2型糖尿病患者。研究表明,二甲双胍可以改善糖尿病患者的骨骼肌胰岛素抵抗并降低全因死亡率和心血管事件的发生率。此外,二甲双胍还可以改善心肌梗塞后的重塑效果和炎症反应,并降低糖尿病患者的房颤发生率。但是,二甲双胍的心脏保护作用是否与心肌Cx43的变化有关尚无定论。本研究旨在探讨二甲双胍对高糖培养的H9c2细胞中Cx43表达的影响及其在H9c2大鼠心肌细胞系中的潜在机制。

1材料与方法

1.1材料与试剂大鼠心肌细胞系H9C2(2.1)购自中国科学院上海大学图书馆;CX43,AMPK,PAMPK,GAPDH抗体购自CellSignalTechnology;绵羊抗兔二级抗体购自武汉谷歌生物科技有限公司;二甲双胍(met)、二甲基亚砜(dmso)、甲基噻唑蓝(mtt)购自sigma;dmem、胎牛血清(fbs)购自美国gibco;ros检测试剂盒、ldh检测试剂盒。从碧云天生物科技有限公司购买BCA蛋白质定量试剂盒;从赛默公司购买增强化学发光(ECL)显影剂;从比奥泰克公司购买Epoch多功能微板阅读器;从比奥拉德公司购买POWERPAC通用电泳装置。

1.2细胞培养和分组h9c2细胞在含10%fbs的dmem培养基中培养,并置于5%co2,95%o237°c培养箱中。当细胞占培养皿的80%-90%以上时,用PBS缓冲液冲洗3次,加入1毫升0.25%胰蛋白酶与细胞充分接触,消化1分钟,然后加入3毫升DMEM培养基终止消化。将细胞悬液加入离心管中,以900 g离心3分钟,去除上清液,稀释细胞,并转移到6孔板上继续培养。当细胞浓度超过80%时,加入3μmol.L-1Met(Met3)和5μmol.L-1Met(Met5)培养24小时,在高糖(250 mmol.L-1)H9C2细胞中培养。

1.3细胞活力测定称取适当量的MTT,溶于去离子水中,终浓度为05gL-1,继续培养4h,除去上清液,每孔加入150μLDMSO,快速振荡10min。使晶体完全溶解。然后用酶标仪测定490nm处的吸光度[D(490nm)]。

1.4细胞毒性测试请遵循试剂盒说明中的说明。简而言之,当细胞超过80%时,请设置以下组:背景空白对照孔,样品对照孔,样品最大酶活性对照孔以及用于处理样品孔的不同药物浓度。在预期的检测时间点之前的1小时,将原始体积的LDH释放溶液的10%添加到样品中酶活性最大的样品中并混合。达到预定时间后,将120μL上清液添加到96孔板的每个孔中,并向其中添加60μLLDH检测工作液,并在室温下于490 nm下测量吸光度30分钟。细胞毒性/%=(处理样品的吸光度-样品对照孔的吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔的吸光度)x100。

1.5细胞免疫荧光测定细胞擦洗后,将药物处理预定时间,然后用PBS洗涤3次,每次3分钟。在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟,每次用PBS洗涤3次,每次3分钟。将山羊血清滴加到载玻片上,在室温下封闭30分钟,然后将封闭溶液添加到封闭溶液中以添加Cx43一抗,并在4°C下孵育过夜。清洗载玻片上多余的一抗,然后将荧光二抗在室温下于黑暗中孵育1小时,然后在黑暗中添加DAPI 5分钟。清洗密封并用荧光显微镜观察图像。

1.6 ROS检测在细胞处理达到预定的时间点后,将DCFHDA用无血清培养基以1:1000的比例稀释至最终浓度10μmolL-1。除去细胞培养基,并将1mL稀释的DCFHDA加入到每个孔中,并在37℃细胞培养箱中孵育40分钟。用无血清细胞培养基洗涤细胞3次以充分除去未进入细胞的DCFHDA。使用488nm的激发波长和525nm的发射波长测量每组的荧光强度。

1.7 Westernblot分析用细胞裂解液裂解提取的蛋白质样品,并用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。调节至相同浓度后,使用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。恒压60V电泳,60min后改为恒压100V电泳结束。蛋白质被转移到PVDF膜上(恒定流量250 mA,4°C转移膜2小时),5%脱脂奶粉在室温下分别封闭2 h,Cx43,AMPK和P-AMPK加入一抗以在振荡器上于4°C孵育过夜,然后洗涤TBST。 3次后,将山羊抗兔二抗在室温下孵育2小时,洗涤后将颜色洗涤。使用ImageQuantLAS4000mini凝胶成像系统拍摄图像,并使用Gelpro32软件进行灰度分析以计算每种靶蛋白的相对表达。

1.8统计分析使用SPSS170软件进行统计分析。测量数据表示为x±s,并使用单向方差检验比较多个组。

2个结果

2.1采用MTT法研究甲硫氨酸对H9C2细胞活力的影响。结果表明,与conn组相比,3、5微摩尔l-1的met处理显著提高了h9c2细胞的活力(p<;0.05)。与met 3组相比,met 5组h9c2细胞活力虽有增加趋势,但两组间无显著性差异(p>0.05),见图1。

2.2乳酸脱氢酶实验结果显示,与对照组相比,met 3组和met 5组乳酸脱氢酶释放量增加,但无显著性差异(p>0.05),见图2。

2.3细胞免疫荧光结果显示,met 3和met5组cx43的表达明显高于conn组,cx43在细胞内的分布更加规则(图3白色箭头)。met3组和met5组间cx43的表达和分布无差异。

2.4荧光显微镜观察met对细胞内ros产生的影响。结果表明,与对照组相比,met 3和met 5组的ros显著降低(图4);与met3组相比,met5组的ros含量进一步降低。

2.5 met对细胞cx43、ampk和pampk表达的影响。western blot结果显示,met3和met5组cx43和pampk的表达明显高于conn组(图5,p<;0.05)。与met3组相比,met5组pampk的表达明显增加(p<;0.05),而cx43的含量无显著性差异。

3讨论

这项研究观察到二甲双胍不仅增加了H9c2细胞的活力,而且降低了高血糖条件下ROS的产生。在分子生物学水平上,我们还发现二甲双胍可在高葡萄糖条件下增加H9c2细胞中Cx43和PAMPK的表达,而减少ROS产生和增加PAMPK表达的作用是剂量依赖性的。

心肌Cx43在维持正常心脏功能中起重要作用。研究发现,心肌发育过程中Cx43缺乏会引起流出阻塞[10],Cx43也参与细胞周期和转录调控。大量研究证实,室性心肌Cx43的表达和分布与室性心律不齐的发生密切相关。

Rutledge和其他研究发现,心肌梗塞后瘢痕边界的Cx43含量显着降低,Cx43也从心肌圆盘转向细胞侧面,导致侧面连接增加。 Rutledge等人使用cSrc抑制剂来增加梗塞边界处Cx43的含量并降低对室性心动过速的敏感性。 Greener等。还发现通过基因转染上调猪心肌梗死心肌Cx43表达可以有效抑制心肌梗死后室性心律失常的发生。动物实验和细胞实验均表明,高血糖症可降低心肌中Cx43的表达。此外,动物实验已经证实,Cx43表达的下降和异常分布与糖尿病中的心律不齐密切相关。在该实验中,我们观察到二甲双胍可以增加Cx43的表达并改善Cx43在高血糖症中的分布。据推测,二甲双胍可降低糖尿病患者心血管事件的发生率和死亡率,并增加心肌Cx43的表达和改善。与发行有关。

氧化应激在导致心脏功能障碍的长期高血糖过程中起着重要作用。过量的ROS产生可导致线粒体渗透运输通道打开,导致线粒体损伤。研究发现活性氧(ROS)在引起心室重构和心力衰竭中起重要作用。减少ROS的产生可以保护细胞免受氧化应激损伤。我们的研究发现,高糖培养的H9c2细胞可增加ROS的产生,但二甲双胍的添加以剂量依赖性方式抑制细胞ROS的产生。因此,我们有理由相信二甲双胍会减少细胞内ROS的产生并参与保护心血管的过程。

研究发现二甲双胍发挥心血管保护作用的机制主要是通过激活AMPK。 AMPK的激活不仅增加血糖摄入,脂肪酸氧化,增加细胞活力,还减少了心肌梗塞引起的炎症反应。该实验还发现二甲双胍通过增加pAMPK的表达来激活AMPK。郭等人发现,激活AMPK会上调Cx43在肾内皮细胞中的表达,并延缓肾内皮细胞的衰老。因此,我们假设二甲双胍上调了心肌细胞中Cx43的表达,并降低了与AMPK激活相关的细胞内ROS的产生。

总之,该实验证实了在高葡萄糖条件下,二甲双胍可以增加H9c2细胞中Cx43的表达并改善其分布。此外,二甲双胍还可以减少细胞内ROS的产生并增加细胞活力。这为二甲双胍在糖尿病患者治疗中的心血管益处提供了重要的实验基础。至于二甲双胍增加Cx43的表达和减少ROS的产生可能与AMPK的激活有关,这有待进一步研究验证。

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