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关于腺病毒、呼吸道合胞病毒和博卡病毒的研究

作者:赏识教育
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-15

腺病毒(HAV)是一种无包膜的DNA病毒,其基因组长度约为25-45 kb。 1956年,科学家莫里斯(Morris)在感冒的黑猩猩的鼻腔分泌物中发现了它。呼吸道合胞病毒(HRSV)是一种RNA病毒,于1953年被发现,属于副粘病毒科,具有两个亚型A和B。博卡病毒(HBOV)是一种非包膜的单链DNA病毒,其基因组DNA长度为约5299 nt。随着分子生物学测试方法的改进,2005年8月,瑞典科学家Allander利用分子生物学技术发现了儿童呼吸道中的第一个分泌物。腺病毒,呼吸道合胞病毒和Boca病毒是引起全世界儿童急性呼吸道感染的重要病原体,严重影响儿童的健康。因此,建立快速有效的分子诊断平台是非常必要和紧迫的。越来越多的研究和实验证实,引起呼吸道感染症状的病原体经常被多种病原体共同感染。由混合感染引起的症状通常比单一病原体感染严重得多,尤其是死亡或超死亡病例。病原体混合感染的结果。传统的检测方法通常会获得较长的结果周期,并且每个实验只能识别一种病原体,不能满足病原体对快速紧急情况的诊断,而且不利于立即采取措施控制其传播,因此需要快速,准确地进行。准确检测技术。它被用于呼吸道病原体的检测,以便获得宝贵的时间来治疗疾病。这项研究近年来利用定量PCR分析法的快速发展建立了三重荧光RT-PCR系统,用于快速检测腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒,它们可以快速有效地靶向腺病毒和呼吸道合胞病毒。鉴定和监测Boca病毒的三种病原体。

1材料与方法

1.1实验材料,阳性对照和试剂

实验室中保存有呼吸道病毒,如腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒;实时一步RT-PCR试剂盒购自TaKaRa;病毒核酸提取试剂盒购自Roche。

1.2方法

1.2.1病毒的总核酸提取取总200μl的病毒溶液,并根据病毒RNA试剂盒(Roche Diagnostics GmbH,德国)提取病毒核酸。根据说明进行具体操作,然后确定回收的核酸的浓度并计算拷贝数。

1.2.2引物和探针的设计从GenBank获得呼吸道合胞病毒,腺病毒和博卡病毒的全长靶序列,并通过MEGA软件进行分析。使用引物和探针设计软件选择区域。 Primer Express设计引物和探针序列,Blast分析这些引物和探针序列以产生特异性引物和探针序列。引物和探针由大连宝生物技术有限公司合成。

1.2.3使用TaKaRa的One Step PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒(Perfect Real Time)建立一步一步三重荧光RT-PCR系统,以建立25μl腺病毒,呼吸道合胞病毒和Boca病毒三重荧光RT-PCR检测系统。按照试剂盒的说明进行组分的组成,核酸的量为5μl。反应条件为42°C,10min; 95°C,10 s; 95°C,5 s; 60°C,1分钟,40个循环。在60℃下收集荧光信号。该仪器使用ABI ViiA7荧光PCR仪器。

1.2.4三重荧光PCR检测的特异性,敏感性和可重复性实验敏感性实验是使用体外RNA转录拷贝数进行的,请参见文献。荧光RT-PCR特异性测试,腺病毒,呼吸道合胞病毒,博卡病毒和其他具有类似临床症状的呼吸道病毒(甲型流感,乙型流感,间质肺病毒,冠状病毒OC43,冠状病毒NL63,冠状病毒HKU1,核酸冠状病毒229E,鼻病毒和以1-4型副流感病毒为模板,根据反应体系和条件进行荧光RT-PCR反应,初步验证反应体系的特异性,参照文献方法进行重复性实验105-102。根据反应体系和条件检测体外转录RNA的拷贝数/μl。平行制备每个浓度的三个样品,计算三个平行样品Ct值之间的变异系数。

2个结果

2.1建立一步一步三重荧光RT-PCR方法

使用设计的引物和探针,建立了一步一步三重荧光RTPCR系统,以检测腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒。

2.2三重荧光RT-PCR检测系统的特异性

检测腺病毒,呼吸道合胞病毒,博卡病毒和其他具有类似临床症状的呼吸道病毒(甲型流感,乙型流感,间质肺病毒,冠状病毒OC43,冠状病毒NL63,冠状病毒HKU1,冠状病毒229E)鼻病毒和副流感病毒1型的核酸以4为模板,根据构建的反应体系和条件进行荧光RT-PCR反应。结果表明,只有腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒的检测结果为阳性。其他呼吸道病毒均为阴性,表明该系统具有高度特异性。

2.3三重荧光RT-PCR检测系统的灵敏度

对体外转录的RNA(RNA拷贝数从105到102拷贝/微升)进行10倍稀释以进行反应系统敏感性实验。结果表明,腺病毒的检测灵敏度达到1.55×102拷贝/μl。呼吸道合胞病毒的检测灵敏度达到1.31×102拷贝/μl; Boca病毒的检测灵敏度为1.17×102拷贝/μl。

2.4三重荧光RT-PCR检测系统的扩增效率

体外转录的RNA拷贝数浓度的对数绘制在横坐标上,荧光RT-PCR循环的Ct值绘制在腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒的标准曲线的纵坐标上。通过分析拷贝/μlRNA和相应的Ct值,三重荧光RT-PCR检测系统的扩增相关系数R2大于0.99。通过计算式E=10-1/SLOPE-1,获得了腺病毒。呼吸道合胞病毒和博卡病毒的扩增效率分别达到92.24%,96.95%和99.70%。

2.5三重荧光RT-PCR检测系统的重复性检测

系统稳定性实验结果表明,HAV,HRSV和HBov1562三重荧光RT-PCR检测系统的变异系数均在3%以下(表明该方法具有较高的重现性。

3讨论

通常,对于呼吸道感染综合征病原体有许多诊断方法。整个开发过程已经经历了传统的检测阶段和分子生物学检测阶段。传统的方法主要包括细胞培养和直接(间接)免疫荧光实验,固相免疫测定,金标准方法,单放射免疫扩散溶血技术(SRH)等。传统的检测方法具有耗时费力,灵敏度低,特异性差的缺点。实时PCR是分子生物学检测方法的快速发展。它具有高灵敏度,高特异性,并且可以实现多种反应。它具有自动化程度高,无污染,实时性和准确性的优点。病原体实验室诊断的最重要技术手段之一。

目前,用于腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒的单定量定量PCR分析已经非常成熟。何锐等。建立了呼吸道合胞病毒的荧光PCR检测方法,其特异性为100%,灵敏度为500 PFU/ml。谭耀珍等。用定量RT-PCR方法建立了针对人三型腺病毒针对病毒六邻体基因的分子诊断方法,其灵敏度可达到5拷贝/μl。同时,成功建立了人类博卡病毒病原体的荧光PCR方法。这些测定只能检测腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒中的一种。为了确定一系列可疑物体中是否存在腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒,需要三个单次实时PCR。该反应有一定的局限性,大大增加了工作量和测试成本。多重PCR是利用当今具有多功能功能的多通道荧光PCR仪(大多数为5通道)和传统的荧光标记来实现呼吸道病原体的高通量快速检测。

在该实验中,使用荧光定量PCR进行多个反应的高通量特征。分别设计了腺病毒,呼吸道合胞病毒和博卡病毒的特异性引物和探针。在ABI ViiA7上构建了单管腺病毒。呼吸道合胞病毒和Boca病毒三重PCR检测法具有100%的特异性,高灵敏度,良好的重现性,高扩增效率,同时可以检测腺病毒,呼吸道合胞病毒和Boca病毒这三种病原体。

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