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FILIP-1L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

作者:学报期刊
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-09

肿瘤细胞的迁移与肿瘤的侵袭和转移有关。肿瘤转移是肿瘤患者死亡的重要原因。因此,肿瘤的侵袭和迁移机制与临床肿瘤治疗策略的发展密切相关。 FILIP-1L(类Filamin相互作用蛋白1,FILIP-1L;以前称为下调的inovariancancer1,DOC1)是卵巢癌细胞系中的一种低表达蛋白,其功能尚不完全清楚。研究发现FILIP-1L与各种肿瘤如乳腺癌和结肠癌的侵袭呈负相关。我们之前的研究还发现FILIP-1L参与了热激因子1(Hsf1)的降解。为了进一步研究FILIP-1L的生物学作用,我们构建了pGEX-4T3-FILIP-1L表达载体。 FILIP-1L融合蛋白用于免疫新西兰白兔,制备FILIP-1L多克隆抗体,为进一步研究FILIP-1L的生物学功能提供了有用的工具。

1材料与方法

1.1材料

pgex-4t3、pgex-4t3-filip-1l(288)、pgex-4t3-filip-1l(893)、pcdna3-flag-filip-1l(893)和大肠杆菌bl21在实验室保存。新西兰大白兔购自河南省实验动物中心。肝癌细胞株hepg2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5和肝永生化细胞购自中国医学科学院上海细胞生物学研究所。谷胱甘肽Sephasse 4B购自GE Healthcare Bio Sciences AB。L-GluthionReduced是一种科学研究产品。Freund、Sadjuantcomplete和Freund、Sadjuantcomplete是从Sigma购买的。活性酯酶是从bio-rad购买的。蛋白酶抑制剂鸡尾酒购自西格玛。辣根过氧化物酶标记抗兔igg是北京中商金桥生物科技有限公司的产品。

1.2方法

1.2.1 GST-FILIP-1L蛋白诱导的表达将pGEX-4T3,pGEX-4T3-FILIP-1L(288)质粒分别转化到大肠杆菌BL21感受态细菌中。挑选单个菌落并接种到1 ml LB培养基中,在37°C下培养14 h,然后在新鲜的LB液体培养基中以1:100的体积进行培养,并在37°C下以180 r/min的速度培养直至A600约为0.6,并加入最终浓度。用1 mmol/L IPTG诱导培养1 h。取200μl细菌溶液,加入50μl5x上样缓冲液,加水煮沸8分钟;另取6 ml细菌溶液4000 r/min,在10°C下离心10 min。丢弃上清液,并将沉淀重悬于200μl的PBS中,然后添加50μl的5×加载缓冲液,并将浴沸腾8分钟。对细菌液和细菌裂解液进行SDS-PAGE蛋白电泳,用考马斯亮兰染色,观察GST-FILIP-1L蛋白的表达。

1.2.2 GST-FILIP-1L蛋白溶解度分析采用上述方法将pGEX-4T3-FILIP-1L质粒转染E.coliBL21,在LB液体培养基中扩增培养,并以1mmol/L的终浓度加入IPTG中。持续6h,4000r。/min,在4°C下离心10分钟,用PBS洗涤细胞2次,重悬沉淀,添加溶菌酶,在冰上超声处理,添加1%TritonX-100,在冰上放置30分钟,4°C, r/min,离心10分钟。分别收集上清液和沉淀物,并进行10%SDS-PAGE蛋白电泳。

1.2.3提取GST-FILIP-1L蛋白。通过上述方法r/min收集细菌溶液,在4℃下离心10分钟,并弃去上清液。向沉淀物中加入8 mol/L的尿素溶液,混合物均匀。以30秒的间隔对沉淀进行超声30秒,共6个循环。将上清液收集在透析袋中,并置于2 mol/L尿素溶液中。将透析袋在4℃透析过夜。将透析液替换为1×PBS,将透析液在4℃透析24小时,并且在透析期间将PBS溶液更换一次。收集透析袋中的液体,以9000 r/min的速度在4°C下离心20分钟,并收集上清液GST-FILIP-1L蛋白质溶液以备后用。

1.2.4纯化GST-FILIP-1L蛋白,取Glutathion Sepharse 4B2ml,加入PBS溶液5ml,混合,4000r/min,4离心5min,弃去上清液。重复操作3次,然后添加1 ml PBS溶液以悬浮珠子。将谷胱甘肽Sepharse4B悬浮液与上述GST-FILIP-1L蛋白溶液混合,并在4摄氏度下旋转过夜。加入10 ml预冷的PBS溶液,悬浮,以4000r/min的速度洗涤Glutathion Sepharse4B,在4°C下离心5分钟,重复操作5次。加入减少了谷胱甘肽的缓冲液1ml,将上清液旋转并以4 4000r/min混合20min,并离心5min。将上清液收集到新的EP管中。谷胱甘肽减少的缓冲液洗脱重复3次。标记洗脱液序列并测试洗脱液的蛋白质纯度。将其储存在80 C进行备用。

1.2.5多克隆抗体的制备取一只新西兰白兔,并从叶前静脉取血作为阴性血清对照。纯化的GST-FILIP-1L(288)蛋白与弗氏完全佐剂等体积完全乳化,然后在多个位置注入动物的背部。每只动物的蛋白质抗原量为400μg。在初次免疫后的第21天和第35天,使用相同剂量的GST-FILIP-1L蛋白并在弗氏不完全佐剂中乳化,以相同的方法进行两次免疫。第二次加强免疫10天后,取耳静脉血以确定抗血清的效价。抗体滴度达到实验要求后,从颈总动脉中收集血液,收集血液,并在37°C下收集血液3 h,以2000 r/min的速度离心10分钟,储存在-80°C。

1.2.6用于检测抗体潜能的间接ELISA方法用抗原稀释液将GST-FILIP-1L蛋白稀释至1μg/ml的浓度,并向每个孔中加入100μl蛋白稀释液以覆盖96孔微量滴定板。免疫前的血清用作阴性对照,并用磷酸盐缓冲液(1:250、1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:1:1)稀释血清,间接ELISA该方法检测抗体效价。

1.2.7多克隆抗体的纯化

1.2.7.1饱和硫酸铵纯化的抗体用PBS以1:5稀释免疫的动物血清,并在4°C缓慢滴加饱和硫酸铵溶液(体积比1:1),并在4°C磁力搅拌过夜。在4℃,r/min离心20分钟后,PBS悬浮液沉淀。通过透析4次以PBS收集透析袋中的抗体溶液12小时。

1.2.7.2去除抗GST抗体取GlutathionSepharse4B1ml,加入5ml预冷的PBS溶液,4000r/min,在4℃下离心5min,弃去上清液。将沉淀物悬浮在PBS中,并重复上述操作3次。将珠粒悬浮在1 ml PBS中,添加5 mg GST蛋白,并将混合物在4°C下以4000 r/min的温度孵育2 h,并在4°C下离心5分钟。用PBS洗涤5次后,加入1ml PBS并悬浮。加入50ml上述饱和硫酸铵的纯化血清,并将混合物在4℃下孵育4小时,离心,并收集上清液。

1.2.7.3亲和层析纯化抗体

(1)取1 ml ActiveEsterAgrose悬浮液,4000 r/min,在4°C下离心5分钟,并弃去上清液。加入1 ml预冷却的单蒸馏水,以4000 r/min的速度悬浮,并在4°C下离心10分钟。重复上述操作5次。

(2)将5 mg纯化的GST-FILIP-1L蛋白放入透析袋中,并将透析袋放入1 mol/L HEPES溶液中,并在4°C透析过夜。

(3)混合ActiveEsterAgrose和GST-FILIP-1L蛋白溶液,并在4°C下孵育过夜。在4°C下以4000 r/min离心10分钟,并弃去上清液。

(4)依次用10ml的PBS溶液,5ml的0.1mol/LGlycine HCl(pH 2.5),10ml的PBS溶液,4000r/min洗涤,并在4℃下离心10分钟。

(5)取上述抗血清1 ml,置于56°C恒温水浴中30分钟,稀释PBS 10次,加入树脂-柱混合物,于4°C孵育过夜,于4000离心r/min,在10°C下离心10分钟,然后回收上清液。沉淀如下进行。

(6)分别用1 * PBS,0.5 mol/L NaCl和0.5%Triton X-ml洗涤抗体-树脂柱,以4000 r/min离心10分钟,然后转移到色谱柱中,用1 * PBS 10毫升和去离子水10毫升。

(7)用0.1mol/L的甘氨酸.HCl(pH 2.5)0.9ml洗涤抗体-树脂柱。将洗脱液收集在干净的无菌EP管中(将2 mol/LTris-HClpH8.0预添加到EP管中),并洗脱3次。分别测定每个试管中的蛋白质(抗体)含量,并将其储存在-80 C进行备用。

1.2.8用于检测多克隆抗体和靶蛋白的结合,制备了SDS-PAGE凝胶。加入不同剂量的纯化的GST-FILIP-1L融合蛋白,并使用常规蛋白电泳转移PVDF膜。将PVDF膜置于1:50稀释的FILIP1L抗体稀释溶液中,并在4℃下孵育过夜。TBST溶液洗涤膜。加入稀释的第二抗体,在室温下在摇床上孵育1小时。在暗室中进行化学发光,曝光和显影。对图像扫描仪拍照并进行分析。

1.2.9结合细胞的FILIP-1L蛋白进行多克隆抗体的检测。在正常条件下培养293T细胞。按照Lipofetamine 2000 Reagent的说明,分别转染PcDNA 3.0和PcDNA 3.0-FILIP-1L(893)质粒。将细胞在37℃,5%CO 2的培养箱中培养48小时。收集细胞并提取细胞蛋白。 SDS-PAGE电泳和PVDF膜转染。使用制备的多克隆抗体作为抗体,通过Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白的结合。

1.2.10常规培养肝癌细胞HepG2,smmc-7721,bel-7402,plc/prf/5和永生化肝细胞中FILIP-1L蛋白的表达,并收集生长状态良好的细胞以提取细胞蛋白,SDS -PAGE凝胶电泳,转移PVDF膜。使用产生的多克隆抗体作为一抗,通过Western blot检测FILIP-1L蛋白在肝癌细胞中的表达。

2个结果

2.1 GST-FILIP-1L蛋白原核表达将该质粒转化到BL21菌株中,挑取单克隆培养物,用IPTG诱导,并通过SDSPAGE分析FILIP-1的表达。结果表明,IPTG诱导后,用pGEX-4T3和pGEX-4T3-FILIP-1L(288)转化的质粒在IPTG诱导后被裂解,分别在25和55kD处有明显的蛋白条带。出现了,但是电泳后没有明显的条带显示。这表明融合蛋白被成功诱导并且主要在细胞中表达。

2.2 GST-FILIP-1L蛋白溶解度分析洗涤并裂解诱导FILIP-1L表达的细胞,分别于4°C,r/min,10 min离心,收集上清液和沉淀物,上清液和将该悬浮液用于10%SDS-PAGE蛋白电泳。结果表明,电泳转染了FILIP-1L(288)的细菌悬液悬浮液后,在分子量为55 kD时有一条清晰的条带,电泳上清液后未观察到清晰的条带,表明FILIP-1L (288)蛋白在细胞中。它主要以包涵体的形式表达[分子量为90 kD的FILIP-1L(893)并未完全表达]。

2.3 GST-FILIP-1L蛋白的纯化GST和GST-FILIP-1L蛋白联合谷胱甘肽Sepharse4BBeads 834的原核表达中华免疫学杂志2016年第32卷,用谷胱甘肽还原(GSH)缓冲液洗脱,SDS-PAGE结果显示在分子量为25和55 kD时获得了纯度较高的GST和GST-FILIP-1L(288)蛋白,而分子量为90 kD的GST-FILIP-1L(893)蛋白的表达和纯度较低。

2.4多克隆抗体滴度用酶板包被纯化的FILIP-1L(288)融合蛋白,并通过间接ELISA法检测兔抗人FILIP-1L多克隆抗体,是A450nm负值的4倍以上。阴性血清。克隆抗体滴度。测试结果表明,所制备的FILIP-1L多克隆抗体的滴度为1:

2.5多克隆抗体的纯化通过使用ActiveEsterAgrose纯化抗FILIP-1L抗体。 SDS-PAGE电泳显示获得了更高纯度的IgG。 IgG重链和轻链之间的二硫键在SDS-PAGE电泳中打开。电泳显示两条分子量分别为25和50 kD的蛋白条带。

2.6多克隆抗体与靶蛋白的结合采用蛋白质印迹法检测制备的多克隆抗体与FILIP-1L蛋白的结合能力。发现与多克隆抗体孵育后,不同剂量的GST-FILIP-1L融合蛋白(泳道1至6)显示条带,并且随着FILIP-1L蛋白量的增加,条带逐渐增厚,但GST蛋白(无泳道)在第7车道上显示)。提示该多克隆抗体与GST-FILIP-1L蛋白具有良好的结合能力,但不与GST蛋白结合。

2.7多克隆抗体与293T细胞中的FILIP-1L蛋白结合,并转染PcDNA3.0和PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)质粒48小时。提取细胞蛋白。 Western blot检测多克隆抗体与FILIP-1L蛋白的结合,Flag IP抗体检测FILIP-1L蛋白的表达。发现在孵育PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)细胞裂解物和多克隆抗体后,以分子量95kD(FILIP-1L)和110kD(FILIP-1L)显示条带。然而,在孵育PcDNA3.0细胞裂解物和多克隆抗体之后,在110kD的分子量处仅发现条带,而在95kD的分子量处未发现条带,这表明在95kD的分子量处无条带。制备的多克隆抗体可以与细胞转染的FILIP-1L蛋白和FILIP-1L蛋白结合。

2.8通过Western印迹检测FILIP-1L蛋白在肝癌细胞中的表达。 Western blot检测FILIP-1L蛋白在不同肝癌细胞中的表达。结果显示在不同的肝癌细胞中存在分子量为110 kD的条带。 ChangliverFILIP-1L在永生化肝细胞中的表达高于在肝癌细胞HepG2和smmc-772中的表达。 1. FILIP-1L在Bel-7402和plc/prf/5细胞中的表达较低。

3讨论

野生型filip-1l由893个氨基酸组成,含有4个双螺旋和2个亮氨酸拉链结构域。在不同的细胞中,有不同的分子量filip-1l剪接形式。目前,对filip-1l的生物学功能尚未完全了解。研究发现filip-1l与肿瘤转移和血管生成有关。filip-1l的表达与卵巢癌细胞系和卵巢癌的侵袭性呈负相关,侵袭严重的肿瘤组织filip-1l的表达明显低于非侵袭性交界性肿瘤组织。filip-1l蛋白在肿瘤血管中的表达抑制肿瘤生长;filip-1的过表达也抑制内皮细胞的增殖和迁移。细胞凋亡增加;腹腔注射filip-1l基因可抑制卵巢癌向腹腔和腹腔器官的扩散。这些结果提示filip-1可能是细胞增殖和迁移的主要抑制因子和凋亡的诱导因子。为了进一步探讨filip-1l在肿瘤转移中的作用及机制,我们构建了两个表达质粒pgex-4t3-filip-1l(288)和pgex-4t3-filip-1l(893),并将其转化为bl21株iptg。诱导表达gst-filip-1l融合蛋白,pgex-4t3-filip-1l(288)的表达水平明显高于pgex-4t3-filip-1l(893)。pgex-4t3-filip-1l(288)和pgex-4t3-filip-1l(893)均以包涵体的形式表达。我们用高浓度变性剂(8mol/L尿素)溶解包涵体,经透析和谷胱甘肽sepharse 4b纯化得到高浓度、高纯度的gst-filip-1l(288)融合蛋白。我们用纯化的GST-FILIP-1L(288)融合蛋白免疫了新西兰白兔,并通过间接ELISA检测了抗血清滴度。结果表明该动物的血清抗体滴度达到1 :表明该动物已接种了GST-FILIP-1L。 (288)蛋白质融合后,体内产生了高滴度的抗FILIP-1L抗体。 FILIP-1L抗体通过亲和色谱纯化,并通过免疫印迹确认。制备的FILIP-1L抗体可以特异性结合FILIP-1L蛋白,转染FILIP-1L蛋白和FILIP-1L蛋白。使用制备的FILIP-1L抗体,WB分析显示,ChangliverFILIP-1L在永生肝细胞中的表达较高,而FILIP-1L在hepG2,smcc-7721,bel-7402和plc/prf/5细胞中的表达较低。实验结果表明,FILIP-1L抗体可以特异性识别FILIP-1L,可用于后续的FILIP-1L功能研究。

肿瘤转移是癌症患者死亡的主要原因。 FILIP-1L通过抑制WNT信号通路和MMP表达,是潜在的重要抗肿瘤分子。我们之前的实验还发现FILIP-1L是热激转录因子1的作用蛋白,并参与Hsf1的降解。目前,FILIP-1L的生物学功能尚不完全清楚,市场上还没有商品化的具有良好性能的抗体。我们的FILIP-1L抗体为进一步研究FILIP-1L的生物学功能提供了有用的工具。

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