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GSK-3β对小鼠骨髓树突状细胞的调控效果

作者:中小学教育
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-13

树突状细胞(DC)的功能主要取决于它们所处的发育阶段。成熟的树突状细胞(mDC)激活免疫反应,而未成熟的树突状细胞(iDC)诱导免疫耐受。在患有自身免疫性疾病的患者中,DC易于成熟,并且大多数处于成熟状态,并且自身抗原的过多呈递会导致自我耐受性和免疫调节功能障碍。因此,研究DC成熟的分子机制,探索新的途径来维持DC的不成熟状态,并通过诱导耐受DC诱导免疫DC再生和恢复免疫平衡,这已成为治疗自身免疫性疾病的研究热点。

GSK-3β是一种多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于真核细胞中,在各种细胞功能活动的调节中具有重要作用,包括代谢,信号转导,细胞周期,基因表达。生长,肿瘤发生和神经保护密切相关。近年来,GSK-3β已在免疫学领域得到发展,它在先天免疫和获得性免疫应答中起着重要作用,因此已成为引起免疫学家关注的焦点蛋白。目前,GSK-3β对DC成熟和功能的影响尚不清楚。

这项研究比较了iDC和mDC中GSK-3β活性的变化,并初步证实GSK-3β是否参与DC成熟和功能的调节。通过小分子抑制剂抑制GSK-3β的活性,并观察GSK-3β在DC上的成熟和功能。进一步探讨了GSK-3β对调节DC成熟的关键转录因子RelB表达的影响,并以GSK-3β为新靶标,为构建耐受DC提供了基础。

1材料与方法

1.1实验动物

6-8周大的SPF纯种雄性C57BL/6和BALB/c小鼠由南方医科大学实验动物研究所提供。

1.2主要试剂

澳大利亚胎牛血清、RPMI 1640培养基和PBS(GiBCO);rhGM-CSF和rhIL-4(PETPYCH);脂多糖和Sb(Sigma);CD11cMcM珠(Meltyi-BioTeC);尼龙毛发(多学科);红细胞裂解液(北京)ByyTurn;阻断抗体CD16/32,大鼠抗小鼠FITC-CD11c;apc-cd40,percp-efflor710-mhc-ii流动性抗体及相应的同型抗体(ebioscience);大鼠抗鼠pe-cd86流动性抗体及其同型抗体(bd);cck-8细胞增殖毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所);丝裂霉素c(roche);三唑试剂,逆转录试剂盒和实时PCR检测试剂盒(Takara);兔抗鼠β-肌动蛋白、GSK-3β及其血清9和Y216磷酸化抗体(CST);兔抗RELB抗体(Santa Cruz);HRP山羊抗兔IgG二级抗体(北京博阿森)。

1.3小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养

小鼠BMDC的分离培养方法参考本实验室发表的文章。无菌裂解C57BL/6小鼠股骨和胫骨骨髓细胞。裂解红细胞后,将细胞浓度调整为1×106/mL,并将每孔4 mL接种到6孔板中,并以20 ng/mL的终浓度添加rmGMCSF。与10 ng/mL rmIL-4在37°C,5%CO2下孵育。在培养的第二天,通过手工方法丢弃悬浮细胞,并补充包含相同浓度的细胞因子的培养基。在第四天,更换培养基以补充细胞因子。在第六天,收集半贴壁和悬浮细胞。这是一个不成熟的DC。锥虫蓝染色用于鉴定生存力,并用CD11c免疫磁珠纯化具有更好生存力的细胞,用于随后的实验。

1.4 DC2.4细胞的培养

树突状细胞系DC2.4购自上海莱迪生物技术开发公司。使用基于37℃,5%CO 2的含10%FBS的RPMI 1640进行孵育。

1.5 SB处理未成熟的DC和分组

收集纯化的未成熟DC,并将其以每孔2×106个细胞铺在12孔板中,并且培养系统为2mL。添加10μmol/L SB或1μg/mL脂多糖,或添加10μmol/L SB 20分钟,然后添加1μg/mL脂多糖或添加等量的DMSO作为阴性对照。继续培养24小时以进行表型,细胞因子和MLR分析。

1.6流式细胞仪检测DC表型

收集DC,用含有2%FBS的PBS洗涤,调节至5×106/mL的浓度,封闭100μL的1μLCD16/32抗体,并置于冰上10分钟。根据说明添加适量的流抗体或相应的同型抗体,在黑暗中于4°C孵育20分钟。通过离心洗涤抗体,然后将其添加到500μLPBS流式细胞仪(FACSCalibur流式细胞仪,BD)中进行检测。

1.7 qRT-PCR检测细胞因子的表达

收集每组DC,使用Trizol试剂盒提取总RNA,并通过Takara逆转录试剂盒合成cDNA,然后进行qRT-PCR反应。反应条件:在95°C下预变性15 s,然后在95°C下预变性5 s,在60°C退火30 s进行40个循环。 PCR引物由他们自己设计,并提交给上海圣工生物工程有限公司合成。 β-肌动蛋白用作内部参考。结果表明,实验组和对照组中靶基因的表达比例以Folds=2-δδCt表示。公式如下:δδCt=(Ct(靶基因)-Ct(β-肌动蛋白))实验组-(Ct(靶基因)-Ct(β-肌动蛋白))对照组。

1.8单向混合淋巴细胞反应(MLR)

无菌摄取BALB/c小鼠的脾脏以制备单个悬浮细胞。裂解红细胞后,用尼龙毛发柱纯化T细胞。通过将细胞浓度调节至2×106/mL,将细胞悬液以每孔100mL的浓度放置在96孔培养板上,作为反应T细胞。收集DC作为刺激细胞。在37℃水浴30分钟后,将丝裂霉素C(25ug/mL)加入细胞中,并将浓度调节至2×105/mL。将每组接种到96孔板中,以该比例进行共培养。 1:10的反应性细胞与受激细胞的比例。每组有三个多个孔。同时,将T细胞设置为阴性对照。培养时间为在37°C和5%CO2下72小时。通过在培养结束前4小时向每个孔中加入20μLCCK-8试剂,在450nm波长处测量吸光度(A)。结果用刺激指数(SI)表示,即(每个实验组的值-对照组的值)/对照组的值。

1.9通过蛋白质印迹法检测蛋白质和磷酸化

未成熟的DC用1 ug/mL脂多糖处理,并通过免疫磁珠纯化。分别在0、30和60分钟收集细胞用于蛋白质检测。提取总蛋白,并通过12%SDSAGE凝胶电泳分离并转移至PVDF膜。将5%脱脂乳在室温下密封3小时,在4℃下孵育过夜,然后与第二抗体杂交1小时。重新洗涤后,通过增强化学发光(ECL)试剂盒检测蛋白质的表达。

1.10慢病毒载体的构建和转染

在GeneBank中查询GSK-3beta(NM_)基因的序列。过表达质粒由广州雷德尔公司构建和鉴定,并确定了慢病毒包装和生物学效价。实验前一天,用6孔板接种2 * 105/mL的DC2.4细胞,培养系统为2 mL。在转染时,根据MOI值= 20制备病毒转染溶液,并加入最终浓度为8ug/mL的聚乙烯。充分混合后,将原始培养基替换用于转染。将细胞培养24小时以观察细胞状态,并更换新鲜培养基。 Western印迹用于检测转染的作用和RelB的表达。转染的细胞分为三组:LV-GSK-3β转染组,空载转染组和空白对照组。

1.11统计分析

使用SPSS 13.0软件进行统计分析。所有数据均以平均值(+标准偏差)表示。 T检验用于两组之间的比较。一种方法是将方差分析用于多个组之间的比较。 LNK或Bonferroni方法用于均方差,Dunnett方法用于方差不均匀,P<用于P&05。

2个结果

2.1 DC成熟期间GSK-3beta活性降低

gsk-3beta活性主要受两个磷酸化位点调控。tyr216磷酸化促进gsk-3beta活性,ser9磷酸化抑制gsk-3beta活性。idc中gsk-3βtyr216的磷酸化程度高于ser9,说明idc中gsk-3β大部分被激活。脂多糖是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,能通过tlr途径强烈促进dc的成熟。1ug/ml lps刺激30和60min后,tyr216的磷酸化水平降低,ser9的磷酸化水平显著升高,说明lps刺激idc成熟过程中gsk-3beta活性降低。提示gsk-3beta可能参与dc成熟和功能的调节。

2.2抑制gsk-3beta活性,促进dc表型成熟

sb是gsk-3beta的选择性抑制剂。经典浓度的1 umol/L锑可显著抑制GSK-3beta的活性。流式细胞术检测idc表面共刺激分子cd40和cd86的表达。结果表明,sb治疗组cd40和c d86的百分率明显高于对照组(均p<;0.01)。因此,抑制gsk-3beta活性可以促进dc表型的成熟。

2.3 GSK-3beta在脂多糖诱导的DC成熟中起炎症作用

s-b治疗后dcs中促炎细胞因子il-6mrna水平显著降低,il-10水平显著升高。抑制gsk-3beta活性可减弱lps诱导的dc中il-6和il-12表达的上调,促进il-10的表达。这表明gsk-3beta在脂多糖刺激的dc活化成熟过程中获得了一种新的功能,即促进炎症反应。

2.4抑制gsk-3beta并降低dc刺激异基因t细胞增殖的能力

sb组和空白对照组bmdc刺激t细胞增殖的能力无显著性差异(p>0.05),且明显低于lps组。这表明sb处理的dc不具有激活同种异体t细胞的能力,sb处理的dc也没有达到完全功能成熟。此外,联合治疗组的t细胞增殖能力低于单纯lps组(p<;0.05),说明抑制gsk-3beta活性可减弱lps诱导的dc刺激异基因t细胞增殖的能力。

2.5 GSK-3beta过表达下调DC成熟关键转录因子RELB的表达

用携带gsk-3beta基因的慢病毒载体转染dc2.4细胞,western blotting检测gsk-3beta和relb的表达。结果表明,lv-gsk-3beta组gsk-3beta的表达明显高于非转染组和非负载转染组,说明携带gsk-3beta基因的慢病毒成功地转染了dc2.4细胞并在细胞中正确表达。lv-gsk-3beta组的relb水平明显低于其他两组,提示gsk-3beta的过度表达可下调relb的表达。

4讨论

iDC诱导免疫耐受及其在自身免疫性疾病中的应用已成为热门话题。最近的研究表明,在体内输入iDC可以诱导免疫耐受,从而显着缓解系统性红斑狼疮小鼠的症状。然而,在机体复杂的炎性环境的刺激下,输入到机体内的iDC迅速成熟,并且其治疗效果受到严重影响。因此,深入研究调节DC成熟的信号传导途径和分子机制以及干预以维持DC的未成熟状态是iDC诱导的自身免疫性疾病免疫耐受治疗的关键。

gsk-3β是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,平衡促炎/炎症细胞因子的表达,影响免疫细胞的分化、成熟和功能,在先天免疫和获得性免疫中发挥重要作用。本研究结果表明gsk-3β参与了小鼠bmdc成熟和功能的调节。发现idc中gsk-3β高度活化,脂多糖处理后gsk-3β活性显著降低,提示gsk-3β活性与dc的成熟有关。进一步抑制gsk-3β活性后,dc表面分子cd40和cd86的表达明显上调,表明gsk-3β活性的抑制可促进dc表型的成熟。高活性gsk-3β抑制dc的自发成熟。这个结果与亚历山德里尼的研究是一致的。而10μmol/L的Sb处理下调了DC促炎细胞因子IL-6的表达,而抗炎细胞因子IL-10的表达明显上调,其刺激异基因T细胞增殖的能力没有提高。通过抑制gsk-3β活性而激活的dc不能达到功能完全成熟,其促进免疫应答的能力相当有限,仍属于耐受dc。蒋的研究表明,β-catenin信号通路的激活上调了小鼠dc细胞cd86的表达,但对炎性细胞因子的表达无明显影响。此时dc仍具有诱导调节性t细胞和免疫耐受的功能。连环蛋白是gsk-3β的下游蛋白,抑制gsk-3β活性可提高β连环蛋白的稳定性。因此,gsk-3β可能通过β-catenin途径影响dc的表型。

当DC处于未成熟状态时,GSK-3β被高度激活,从而抑制DC的自然成熟。然而,在脂多糖诱导的DC成熟过程中,GSK-3β获得了新的功能,其在促进炎症中起作用。 GSK-3β的抑制作用减弱了脂多糖诱导的促炎细胞因子IL-6和IL-12的表达,并促进了抗炎细胞因子IL-10的表达,这与Martin的研究完全一致。另外,抗炎因子IL-10的表达增加,促炎细胞因子IL-6和IL-12的表达降低,这可能是抑制脂多糖能力的重要原因。在GSK-3β后诱导DC激活的T细胞。

DC的成熟和功能与NF-κB途径的激活密切相关。在NF-κB的五个成员中,RelB基因的激活对于DC成熟至关重要。 RelB基因敲除小鼠发展为DC成熟障碍,而沉默的RelB DC长时间处于未成熟状态,并具有诱导免疫耐受的功能。动物研究表明,体内注入RelB沉默的DC可以有效抑制移植排斥并缓解自身免疫性疾病的症状。因此,通过使RelB沉默而使iDC沉默的能力被认为是诱导体内免疫耐受的最佳选择。 DC2.4是由转染了GM-CSF,v-myc和v-raf基因的C57BL/6小鼠骨髓细胞建立的不成熟永生细胞系,其形态和功能与源自小鼠骨髓的DC相似。

在该实验中,构建了过表达GSK-3β的慢病毒载体,并将其成功转染到DC2.4细胞中。结果表明,GSK-3β的过表达降低了RelB蛋白的水平,这与Neumann在人类T细胞中的研究一致。诺伊曼发现,GSK-3β促进RelB的泛素化,并通过诱导RelB的磷酸化被蛋白酶体降解。在iDC中,GSK-3β保持高活性,并且可能是诱导RelB降解的关键蛋白,通过诱导RelB降解将RelB保持在较低水平。这进一步表明我们可以在iDC中过表达持续活性的GSK-3β,长时间保持RelB处于低表达水平,从而阻止DC的活化和成熟,从而治疗自身免疫性疾病。

总之,我们的结果表明,GSK-3β在DC成熟过程中起着重要作用。一方面,在iDC中,高活性的GSK-3β可以维持DC的未成熟状态,GSK-3β的失活促进DC表型的成熟。另一方面,在DC成熟过程中,GSK-3β获得了一种新的功能。它起着促炎作用。此外,我们首次发现iDC中GSK-3β的过表达可以下调RelB蛋白的水平,这表明在DC发育的早期阶段,我们可以采取一些措施来增加GSK-3β的活性。例如构建持久激活的GSK-Ser突变。 3β,从而限制了RelB的表达,使得DC长时间处于未成熟状态。 GSK-3β可能是构建新型耐受DC并诱导自身免疫疾病治疗中免疫耐受的新靶标。

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