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关于四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的表达

作者:对外贸易
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-05

多不饱和脂肪酸(PUFA)对人体具有独特的作用和意义,是一类被广泛研究并引起广泛关注的脂肪酸。 PUFA包括两种类型的omega-3和omega-6 PUFA,每种都包括具有不同碳链长度和变化量的不饱和键的多个成员。通常将20 C和22 C的多不饱和脂肪酸称为长链多不饱和脂肪酸(LCPUFA)。 DHA(22: 6n-3),EPA(20: 5n-3)和ARA(即花生四烯酸20: 4n-6)是体内活性最高的三种多不饱和脂肪酸,已被证实可促进大脑发育维持功能,在预防和治疗心血管疾病,炎症和癌症等各种疾病中起着重要作用。 DHA和ARA已广泛用作婴儿配方食品等重要的营养补品; EPA通常被称为血管清除剂,通常与DHA一起食用,这对心血管疾病患者有益。现有研究结果清楚地证实,哺乳动物DHA的生物合成始于α-亚麻酸(18: 3n-3)。第一个是δ6-脂肪酸去饱和酶,它将其转换为18: 4n-3,然后通过δ6-脂肪酸延伸酶将其转换为20: 4n-3,然后再通过δ5-脂肪酸去饱和酶将其转换为EPA。 (20: 5n-3),并在δ5-脂肪酸延长酶的作用下进一步扩展至DPA(22: 5n-3)。DPA转换为DHA的下一步是经历一个更复杂且效率低下的过程,称为“ Sprecher途径”:DPA进一步扩展为24: 5n-3,然后通过δ6-脂肪酸去饱和酶将其转换为24: 6n-3,然后进行β氧化形成DHA(22: 6n-3)。使用相同的酶系统,omega-6多不饱和脂肪酸(如ARA)的合成相似。可以看出,四种酶δ6/δ5-脂肪酸去饱和酶和δ6/δ5-脂肪酸延长酶在多不饱和脂肪酸的合成中特别重要。但是,研究表明,这些酶在哺乳动物中的效率相对较低,例如,α-亚麻酸向DHA的转化率低于1%,亚油酸的转化率(LA,18: 2n- 6)到ARA仅为0.2%。因此,人体对更多PUFA的需求主要取决于食物来源。为什么哺乳动物中的大多数ALA或LA不能转化为更具活性的长链多不饱和脂肪酸?许多学者进行了各种各样的研究,但是结论并不完全令人信服,甚至不同的研究结论也是矛盾的。我们设想,通过多不饱和脂肪酸合成中几种关键酶活性的基因修饰,可以更好地解释长链多不饱和脂肪酸合成的问题。在这项研究中,使用了人源的δ6-脂肪酸去饱和酶基因fads2和δ5-脂肪酸去饱和酶基因fads1以及小鼠衍生的δ6-脂肪酸延伸酶基因elovl5和δ5-脂肪酸延伸酶基因elovl2。脂肪酸合成过程中的重要基因在哺乳动物细胞(HEK293T)中过表达,这增加了相应的酶活性,并向细胞培养基中添加了LA和ALA脂肪酸底物。一定时间后,收集细胞。提取脂肪酸,通过气相色谱-质谱法(GC-MS)分析脂肪酸的组成和变化,探讨哺乳动物细胞中多不饱和脂肪酸合成中的一些深层次问题。

1材料与方法

1.1材料

大肠杆菌DH5α和质粒pcDNA3.1(-)已保存在实验室中。 HEK293T细胞购自北京协和医学院细胞库。限制性酶,T4 DNA连接酶,总RNA提取试剂RNAiso plus,RT-PCR试剂盒等购自Bao Bioengineering(Dalian)Co.Ltd.质粒提取试剂盒,PCR产物纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒购自天根生化技术(北京)有限公司。转染试剂LipofectamineTM 2000是Invitrogen的产品。用于细胞培养的培养基,血清,培养皿等均为Hyclone产品。

1.2方法

1.2.1构建人δ6-脂肪酸去饱和酶基因(fads2,编码445个氨基酸)和δ5-脂肪酸去饱和酶基因(fads1,编码448个氨基酸)和源自小鼠脂肪的δ6的基因表达载体氨基酸延伸酶基因(elovl5,编码300个氨基酸)和δ5-脂肪酸延伸酶基因(elovl2,编码297个氨基酸)。四个基因多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2串联表达。在pcDNA3.1质粒上构建的每个靶基因均具有独立的启动子和终止信号polyA,因此独立表达不会相互影响。该多基因表达载体的总大小为12 760 bp。特定的载体构建方法已经公开[11],在此不再详细描述。

1.2.2细胞培养和瞬时转染HEK29 3T细胞培养基,辅以1% BIS抗体(青霉素10×000 U/mL+链霉素10×000μg/ml)、1%丙酮酸钠(11 mg/ml)、1%非必需氨基酸和10%胎牛血清在高糖DMEM中。转染前1天,将培养细胞分散于60mm平板上,在5ml无双抗体培养基中培养,加入亚油酸(la)和α-亚麻酸(ala)。当它生长到90%汇合时,它被用于转染。按照LipofectaminetM2000的指示进行转染操作。转染质粒pcdna3.1-f2f1-e5e2和对照质粒pcdna3.1-egfp各约8ug。转染48小时后,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,收集备用。

1.2.3 rt-pcr检测靶基因的过度表达。上述细胞的三分之一用于rt-pcr检测。总rna的提取和rt-pcr实验是按照bao生物工程(大连)有限公司有关试剂的规格进行的,简言之,总rna提取后,对每个样品的含量进行定量测定,然后对总rna中的rna进行重新编码。变成一个DNA。取2μg L的逆转录产物进行PCR检测。每个pcr反应体系为25μg l,用于检测目的基因表达的引物列表如下(actd-s和actd-a用于检测内部参考基因βactin)。pcr反应结束后,用电泳法检测5ugl左右的基因表达。

提取1.2.4个脂肪酸,用气相色谱-质谱联用仪分析收集到的剩余2/3细胞进行脂肪酸提取:用去离子水冲洗三次,以1000 r/m离心5分钟,加入1毫升2.5%硫酸/甲醇溶液,轻轻混合,80℃水浴90分钟,冷却至室温,加入1.5毫升0.9%氯化钠溶液和1毫升正己烷。将脂肪酸以3000r/min离心5min提取至有机相,上清液经干燥、氮气浓缩、80c保存,gc-ms检测时加入适量正己烷稀释液。所用仪器为安捷伦GC-MS HP-5890/HP-5971。试验参数由Kang等人报告。

1.3统计分析

脂肪酸含量和其他结果用x(+s)算术平均值(+标准差)表示。学生st检验用于比较各组间的数据。以p<;0.05作为判断统计学差异显著性的标准。每种脂肪酸的百分比通过将其峰面积除以表1中列出的所有脂肪酸峰面积之和来计算。

2。结果和分析

2.1转染4个外源靶基因均获得过表达。

使用多基因表达载体pcDNA3.1-F2F1-E5E2进行转染,将pcDNA3.1-EGFP质粒作为转染过程中的对照,绿色荧光可以准确反映出转染效率。转染后第二天,观察到细胞,并观察到对照组的绿色荧光。转染后48 h,绿色荧光达到最强状态,成功转染了90%以上的细胞,表明转染实验成功。转染48小时后,从细胞中收集总RNA用于RT-PCR实验。结果表明,pcDNA3.1-F2F1-E5E2转染的细胞中每个目的基因均成功表达。

2.2外源目的基因的过表达提高了LA和ALA转化为长链PUFA的能力

在确认所有四个靶基因均通过RT 3多不饱和脂肪酸具有更强的转化能力,EPA,DPA和DHA几乎增加了两倍以上,而DHA含量是in_-3多不饱和脂肪酸中最高的。显然,在该实验条件下,_- 3多不饱和脂肪酸的生物合成效率远高于_-6多不饱和脂肪酸的生物合成效率。另外,结果还表明四个靶基因的过表达并没有改变_-6和_-3多不饱和脂肪酸之间的比例。

3讨论

在脂肪酸合成中,脂肪酸去饱和酶是一类重要的酶,它以其自身的酶特异性在碳链上的特定位置引入双键以产生去饱和作用。另一类重要的酶是脂肪酸延伸率。通过碳链延长酶的活性将较短的脂肪酸转化为较长的脂肪酸的酶。这两种酶共同将LA和ALA转化为哺乳动物中的长链多不饱和脂肪酸。

目前在哺乳动物中发现了四种脂肪酸去饱和酶:δ9,δ6,δ5和δ8脂肪酸去饱和酶。 δ9脂肪酸去饱和酶分别催化从16: 0和18: 0到16: 1n-7和18: 1n-9的转化,这在所有哺乳动物中广泛存在,但不参与哺乳动物PUFA的生物合成。脂肪酸去饱和酶是涉及动物中PUFA生物合成的第一个限速酶,其中18: 2n-6和18: 3n-3和少量16: 1n-7和18: 1n-9为底物。 δ5脂肪酸去饱和酶的反应底物为20: 3n-6和20: 4n-3和少量的18: 2n-7和20: 2n-9。该酶对omega-3系列脂肪酸具有更强的酶。活性高,反应速率高于δ6脂肪酸脱氢酶;在大鼠睾丸中发现了δ8脂肪酸去饱和酶,它可以催化20: 2n-6转化为20: 3n-6。

在哺乳动物中发现了七种脂肪酸碳链延长酶,称为ELOVL 1-7。其中,ELOVL-1,ELOVL-3和ELOVL-6脂肪酸延长了饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸,而ELOVL-2,ELOVL-4和ELOVL-5延长了多不饱和脂肪酸。 ELOVL-5还可以延长某些单不饱和脂肪酸的含量,但是主要延长γ-亚麻酸-CoA(18: 3n-6 CoA)的寿命,而ELOVL-2主要延长PUFA的22C的寿命。除了扩展28C和30C超长链饱和脂肪酸外,ELOVL-4还扩展了28C38C超长链多不饱和脂肪酸(在视网膜,睾丸和大脑中独特表达)。 ELOVL-7的底物尚不清楚,体外实验表明,它主要延长20C超长链饱和脂肪酸的寿命。

因此,哺乳动物中长链多不饱和脂肪酸的合成主要依赖于δ5和δ6脂肪酸去饱和酶以及ELOVL-2和ELOVL-5脂肪酸延伸酶的作用。这就是为什么本研究选择编码这四种酶的基因作为靶基因的原因。在这项研究中,这四个基因的转基因技术在HEK293T细胞中过表达,并且大大提高了将LA和ALA转化为长链多不饱和脂肪酸的效率。这项研究的结果也清楚地证实了哺乳动物的长体。链多不饱和脂肪酸的合成主要依赖于δ6和δ5脂肪酸去饱和酶以及δ6和δ5脂肪酸延伸酶的作用。从我们的研究中可以看出,哺乳动物本身形成了某种平衡机制,该机制可以抑制大量高水平合成长链多不饱和脂肪酸(例如DHA,ARA等),但是会通过δ6和δ5脂肪酸去饱和酶δ6和δ5脂肪酸延长酶的过表达可破坏哺乳动物的平衡机制,并显着提高DHA,ARA等的合成水平。至于为什么哺乳动物需要这种机制来抑制长链多不饱和脂肪酸的合成并依靠食物来补充这些重要营养素,有必要从进化的角度进行深入研究。

我们的研究也为哺乳动物生产多不饱和脂肪酸提供了重要依据。如果这项研究中的基因表达载体可以在转基因动物中获得相似的效果,则可以在动物产品中获得更高水平的长链多不饱和脂肪酸。此外,在这项研究中,通过过量表达δ6和δ5脂肪酸去饱和酶以及δ6和δ5脂肪酸延伸酶,可以清楚地看到DHA和EPA的增加远高于ARA的增加,表明omega-3系统是不饱和的。脂肪酸的生物合成效率高于omega-6多不饱和脂肪酸。基于此,通过优化LA和ALA的添加比例,可以获得更多的ω-3多不饱和脂肪酸,例如DHA和EPA。

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