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SELEX技术的研究进展及在医学中的应用分析

作者:商品经济
出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-13

指数富集系统进化(selex)技术是一种获得高选择性、高亲和力的寡核苷酸的筛选技术。所制备的产品称为适应症。身体(阿普塔姆厄斯德勒)。该适体安全无毒,具有特殊的三维结构,保证了其与靶分子的高比结合,进一步改变了靶分子的生物活性和生命历程。适体的最大优点是缺乏免疫原性、分子量小、化学合成、稳定性好、易于修饰和标记,并且比传统的化学和免疫学方法具有无可比拟的优越性。近年来,在传统sel-ex技术的基础上,各类衍生selex技术不断发展和完善,广泛应用于生命科学研究、生物医学等领域,特别是在疾病的诊断和治疗方面,显示出良好的应用前景。应用前景广阔。几种适体诊断技术和适体药物已进入临床试验或临床应用阶段。

1 Selex技术简介

1。1筛选过程

根据分子生物学原理,selex技术首先构建了一个随机寡核苷酸库。随机核苷酸序列的长度约为20-40bp。不同的立体一致性可以覆盖几乎所有种类的自然物种。目标分子。靶物质与随机文库在一定条件下混合,形成文库海洋标准络合物,洗脱未结合的核酸,富集与靶物质结合的核酸分子,后者是PC R扩增的模板。将所得产物分离纯化,作为下一轮筛选的模板。反复地,通过多轮(8-15轮筛选),充分去除与靶不结合或亲和力较弱的核酸分子,分离与靶分子亲和力较强的核酸分子,它们的纯度是筛选轮数的增加和增加。最后选择的文库进行克隆测序和特定修改。经过这些步骤,获得的特异性识别目标分子的核酸是适体。

1.2优点和特点

1)亲和力强,特异性强。在适体和靶标之间,通过互补的三维结构,相互作用后形成一个强而稳定的络合物,离解常数通常可以达到pmol/l-nmol/l的水平,并能区分靶标结构。不同之处。

2)图书馆容量大,认知度广。selex技术的靶点远不止经典的抗原抗体结合反应。除了蛋白质和核苷酸分子,它还可以是糖、氨基酸、维生素、抗生素、金属离子、有机染料,甚至细菌和病毒。完整的细胞或组织,如寄生虫,几乎包含自然界中所有的物质。

3)易于合成,易于获取且易于修改。适体的大小小于常规抗体的大小,筛选过程简单,周期短,对实验室的要求不高,自动控制的潜力很大。经过化学合成和修饰后,可以保持原始的生物活性,并可以增强其稳定性,并可以添加其他新的化学性质来参与各种类型的反应。在标记了荧光,生物素和纳米金颗粒之后,已经开发出用于疾病诊断的新方法,例如分子成像技术。

4)重复性好,纯度高。整个筛选和制备过程均在人工控制下,所得适体几乎在生产批次之间没有差异,从而有利于将来的大规模生产和应用。

5)分子量小,稳定性高。与抗体或酶相比,适体在化学性质上更稳定,不易降解,对温度不敏感,存储时间长,并且即使在变形后也可以在短时间内重新折叠,从而便于在室温下运输。

6)易于使用。通过SELEX技术获得的适体也称为核酸型抗体,它优于传统抗体,因为它不具有免疫原性,因此可以获得一些免疫原性低或什至没有免疫原性靶分子的适体。还省略了制备传统抗体的动物实验,这些实验直接从体外文库获得。而且,适体更易于通过细胞膜,并且没有毒性,这便于检测细胞中的靶分子并实现多级调节,并且可以被人体快速代谢和清除。经过特定的化学修饰后,半衰期可以延长。提高稳定性并促进科学研究和疾病诊断与治疗。

2 SELEX技术的发展

目前,SELEX技术中出现了一些新的筛选方法,并且筛选出了越来越多的与各种靶标相对应的适体。各种新模式,例如毛细管电泳,硝酸纤维素膜过滤,磁珠分离,亲和色谱,Non SELEX,无引物PCR SELEX,微流体SELEX,生物芯片SELEX,原子力显微镜等,也可用于筛选适体。同时,出现了SELEX技术和定量PCRSEL-EX技术与流式细胞术,SELEX技术和ELISA的结合,大大提高了筛选的效率和准确性。

2. 1减去SELEX技术

减法SELEX技术是一种改进的SELEX技术。靶向全细胞的减法SELEX技术是在筛选过程中靶向完整细胞,并取消与已知或未知共有靶标结合的配体,然后减去二级随机文库。转到特定目标的筛选。其意义在于可以从两组高度同源的完整细胞中筛选出其中一种细胞的特异性适体。该技术可用于发现新的肿瘤细胞识别结构,并可进一步用作独立执行靶向治疗或携带药物的“生物导弹”,并将在未来的肿瘤治疗中发挥巨大作用。

2. 2种自动化SELEX技术

传统的SELEX工艺需要一系列重复且繁琐的操作,从而使筛查相对耗时且劳动强度大。自动化SELEX技术的建立可以简化筛选过程,节省时间和物品消耗,实现高通量和有限范围,并达到同时筛选多个目标分子的效果。自动化的SELEX技术离不开现代分离仪器的合作,而后者的发展推动了前者的发展。 2001年,使用Biome 2000自动化工作站成功筛选了溶菌酶的特定适体。通过该自动筛选平台,在不到2天的时间内完成了12轮筛选。

2. 3引导式SELEX技术

适体的特异性是整个SELEX技术的核心。为了增加适体的特异性和稳定性,可以将非特异性结合靶标的已知分子掺入文库或与靶标预混合。然后进行筛选,从而可以获得仅与靶标特异性结合的适体。在2002年,Hamm等人。将该技术与抗个体基因型方法结合使用,成功获得了针对特定激酶抑制剂的特定RNA适体。 Martell使用特殊的靶向SELEX技术,从随机表达盒杂交文库中筛选出对E2F蛋白具有高亲和力的RNA适体。

3 SELEX技术在医学中的应用

3. 1 SELEX技术在基础医学研究中的应用

核酸适体与目标物质特异性结合的能力可以帮助我们发现疾病的发病机制。轮盘赌等。提出将selex技术与基因表达序列分析相结合,通过自动序列提取建立转录因子结合位点定位模型。通过对转录因子适体文库中的序列进行测序,可以知道蛋白质结合位点的特异性,并且可以在不同的核苷酸位置搜索一些在基因组中从未研究过的结合位点。selex技术发现了非独立碱基的出现顺序,为阐明其结合机制等提供了线索。trf1二聚体在端粒上有两个相同的识别半位点,它们之间的距离可以改变,并且这两个半位点的顺序没有差别。这为探索端粒长度的调控机制提供了新的依据。

三.2 selex技术在疾病诊断中的应用

肿瘤细胞及其标志物的早期检测对于肿瘤的诊断和预后至关重要。当前,已经筛选了多种肿瘤特异性适体,例如急性髓细胞白血病的适体,急性淋巴细胞白血病的适体。神经胶质瘤适体TDOS的适体TDOS,非小细胞肺癌的适体,小细胞肺癌的适体,乳腺癌的适体,结肠癌的适体,小鼠肝癌的适体,卵巢癌的适体。他们可以特异性地鉴定肿瘤细胞,仅需要少量的肿瘤细胞即可进行准确的鉴定和分型。在将适体与纳米颗粒结合之后,进行比色检测以观察颜色的变化,以确定是否存在靶细胞。该实验非常敏感,样品中靶细胞的数量可以检测到一百多个,不需要昂贵的检测设备以及标记和修饰待测靶物。因此,有可能成为常规筛查活体标本中新生儿肿瘤细胞的新程序。同时,肿瘤细胞的分子成像技术也已经发表。它可以在细胞水平上直观地描述和测量生物过程,不仅可以定位病变,还可以观察一些影响肿瘤细胞行为的生物学过程,并观察肿瘤细胞对药物的作用。反应。在Kim和其他研究将前列腺特异性膜抗原(PSMA)的特异性适体与金纳米材料结合后,具有PSMA的前列腺癌细胞可以被特异性标记并用作前列腺肿瘤的造影剂。在成像诊断中,成像时间比传统的造影剂更长,副作用更小,应用价值更显着。

SELEX技术在血液生化检查中也显示出一定的应用前景。用它来检测血液中的某些目标分子将比传统方法更具特异性和效率。脑钠肽(BNP)通常在临床上用于评估急性心力衰竭或急性呼吸窘迫患者的病情和预后。 Lin等。使用SELEX技术的原理来筛选与BNP特异性结合的适体。在微流体测试模式下,荧光标记的适体可以快速测量血液中BNP的浓度,这比放射免疫测定或免疫测定技术更准确,更经济。反应蛋白(CRP)是人体在压力下产生的一种非特异性急性期反应蛋白。 CRP与心血管疾病(如冠状动脉粥样硬化和心肌梗塞)相关。 Bin等。开发出具有光化学特性的CRP特异性适体,当血液中CRP浓度超过0.005 mg/L时可以检测到,并且灵敏度很高。这项成就为开发新型CRP诊断试剂奠定了基础。

SELEX技术还用于病原微生物的检测,它可以克服传统检测方法的特异性和敏感性方面的缺陷,并为开发新的检测试剂盒提供有力的支持。例如,特定的适体CSRI 2. 11与分枝杆菌的结合比传统的培养物鉴定方法对时间更敏感。丙型肝炎病毒适体ZE2可以与酶联免疫吸附试验结合使用,以实现早期丙型肝炎的筛查不受检测抗体的窗口期的限制。在临床实践中,疟疾寄生虫乳酸脱氢酶的适体PL1可以很好地区分患者感染了间日疟原虫还是恶性疟原虫。

3. 3 SELEX技术在疾病治疗中的应用

SELEX技术在疾病治疗中的功效日益受到关注。适体在体内与靶分子结合,并且理论上可以影响靶分子的生理功能和代谢过程,并且靶分子还可能经历信号转导或什至丧失原始功能,直接或间接地阻断了靶分子的进程。疾病。这样开发的靶蛋白功能阻滞剂已越来越显示出其巨大的潜力。世界上第一种适体药物是美国食品和药物管理局于2004年批准的咪达唑仑钠,用于治疗与年龄有关的黄斑变性。

SELEX技术在治疗凝血病中具有一定的意义,并且已被发现可以用作抗凝和抗血栓形成药物的适体。它的结合位点是凝血酶和血纤蛋白原结合的肝素结合位点。现场。在免疫系统疾病的治疗中,还获得了具有药物开发潜力的特定适体,例如可用于拮抗自身抗体以治疗系统性红斑狼疮的适体,以及刺激T细胞释放的适应症。身体。为了治疗肿瘤,基于SELEX技术开发的适体药物处于最前沿,并已进入临床试验阶段。例如,对实体瘤和复发性急性髓性白血病具有良好疗效的AS1411,具有与金纳米棒连接的适体,可用于肿瘤靶向的光热疗法。适体药物作为抗病毒药物,也显示出良好的前景,例如抑制狂犬病病毒的复制和干扰HIV的体内合成。另外,核酸适体也可以用作转运工具以将药物特异性地递送至靶细胞或组织以获得位点特异性清除的治疗效果。较成熟的细胞载有阿霉素以杀死前列腺癌细胞。复合适体药物。

4 Outlook

目前,越来越多的用于疾病诊断和治疗的适体逐渐被筛选出来,并广泛应用于生物医学的各个领域。但是,其在临床中的大规模应用还为时过早。仍然有许多问题需要解决。例如,具有高特异性和高亲和力的适体的数量相对较少。在复杂环境中的实验室环境中筛选的适体的实际效果尚未完全了解。筛选过程需要进一步简化,产品的特异性和稳定性需要进一步提高,适体的修饰和优化需要进一步阐明。相信随着现代技术的进步,上述各种问题将最终得到克服,并且SELEX技术在生命科学和生物医学领域的应用前景将更加广阔。

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