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Daxx对K562细胞向巨核细胞分化的抑制作用

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出处:www.lunrr.com
时间:2019-10-31

白血病是一种严重危害人类生命和健康的血液系统恶性肿瘤。其生物学特征是细胞增殖失控,分化和成熟受到阻碍,正常的凋亡过程受到阻碍,从而导致异常分化的细胞增殖。抑制白血病细胞的增殖,促进白血病细胞的分化和凋亡,是治疗白血病的基本方法。死亡域相关蛋白(Daxx)是一种受体细胞质死亡域结合蛋白,在细胞凋亡,转录调控和病毒感染中起重要作用。 Daxx可以通过结合DNA结合转录因子E2A,Ets-1,Pax3和Pax5参与基因表达的调节。 Pax和Ets转录因子参与许多类型细胞的分化活动。 Daxx可能通过影响转录因子来调控细胞。分化。 Daxx通过与转录因子E2A结合来抑制E2A的功能,从而抑制了心肌细胞的产生并参与了心肌细胞的分化过程。 Daxx基因在白血病细胞中广泛表达,在人类急性白血病(急性白血病,AL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和其他血液学恶性细胞中可以看到Daxx表达。 Daxx在这些血液疾病中的具体作用机理目前尚无太多研究。 Daxx在白血病细胞中的广泛表达与白血病细胞的分化有关,迄今尚无相关报道。在本研究中,以K562细胞为研究对象,以研究Daxx和K562细胞分化为巨核细胞之间是否存在相关性。

材料和方法

1种主要试剂

K562细胞系由嘉兴医学院提供; DMEM培养基和新生小牛血清购自HyClone; Daxx是从Sigma购买的; G418购自Amresco;兔抗CD41和CD61购自BD。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和硝基蓝四唑(NBT)购自杭州新鑫生物技术有限公司。 RNA逆转录试剂盒和实时PCR试剂盒购自Toyobo Biotechnology Co.Ltd。蛋白标记购自Thermo; Lipofectamine 2000购自Invitrogen。

2种主要方法

2.1细胞培养将K562细胞系保存在该房间并常规传代培养。将细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。

2.2建立稳定的过表达Daxx的K562细胞系(Daxx-K562)将对数生长期K562细胞接种在6孔板中,每孔用50μL无血清DMEM培养基稀释至1μgGFPDaxx质粒和GFP空质粒(GFP)。 -Daxx质粒和不含GFP的质粒由嘉兴学院潘伟博士提供;用50μL无血清DMEN培养基稀释1μLLipofectamine2000。将该质粒与Lipofectamine 2000混合,然后分别在室温下静置20分钟,并接种在培养板上。将细胞置于37℃,5%CO 2的培养箱中48小时,并通过荧光显微镜观察表达。添加G418后,更改溶液并继续培养。选择G418后两周,通过有限稀释法获得单个荧光表达细胞,并继续培养以建立GFPDaxx-K562细胞。

2.3用Trizol实时荧光定量聚合酶链实时实时实时实时实时实时实时提取总RNA反应条件为0×1778 95 5min,95 30s,55 30秒,72 40个周期。

用2.4cck-8法检测细胞活力。gfp-daxx高表达组和对照组细胞悬液接种96孔板。培养24小时后,在每个孔中加入10μlcck-8,在37℃下培养2小时。酶标法测定在450nm波长附近的吸收。每组有4个多洞,重复3次。

2.5流式细胞仪检测gfp-daxx高表达组和对照组细胞经12-肉豆蔻酸13-醋酸佛波酯(pma)处理72h后的表达情况。用pma未经处理的细胞,pbs洗涤两次收集一个细胞。将pbs稀释至50μl细胞,然后加入1μlpe标记cd61或cd41抗体。PBS在室温下放置30分钟并预冷却。洗两次,然后在机器上检查。

2.6 NBT还原试验:PMA作用72h后取gfpdax高表达组和对照组细胞,与2g/L NBT溶液混合,37℃孵育30min,离心涂片。giemsa染色观察胞浆中有蓝灰色颗粒的阳性细胞。

2.7 western blot收集细胞。PBS洗涤3次后,加入RIPA细胞裂解液。将细胞置于冰上30分钟,在4℃下离心30分钟。收集上清液,用bca法测定蛋白质含量。用30mg总蛋白进行sds-page电泳,转移到pvdf膜上。5%脱脂奶粉在室温下密封1小时。孵育后,加入相应的i-抗性,在4℃孵育过夜,并在室温下加入2小时。最后,使用ecl显色试剂盒在暗室中进行曝光和显影。

三.统计处理

采用spss16.0统计软件进行分析。数据用平均值(+sd)表示。多组比较采用单因素方差分析,双向比较采用bonferroni校正t检验。p<;0.05为显著性差异。

结果

daxx高表达k562细胞株的建立

荧光显微镜观察发现gfp-daxx在细胞内积累,在细胞核内表达。实时荧光定量pcr检测显示,daxx在高表达k562细胞中的表达明显高于对照组。western blot显示daxx在高表达k562细胞中的表达明显增加。

daxx过表达对k562细胞活力的影响

cck-8检测结果显示,daxx过度表达后k562细胞活力明显低于对照组(p<;0.01)。

3pma诱导k562细胞向巨核细胞分化的研究

流式细胞仪分析显示,经pma处理k562细胞后,cd41和cd61的表达增加,如图4所示。western blot结果表明,pma诱导k562细胞分化过程中,p-erk蛋白水平升高,daxx表达下降。

daxx过表达对k562细胞向巨核细胞分化的影响

过表达daxx后,pma诱导gfd-daxx-k562细胞分化为巨核细胞。流式细胞仪检测cd41和cd61的表达明显低于对照组(p<;0.01)。nbt抑制实验结果表明,daxx过度表达后,分化细胞数明显减少(p<;0.05)。western blot结果显示,daxx过度表达后,p-erk蛋白水平较对照组下降。

关于

Daxx最初被发现是一种受体细胞质死亡域结合蛋白,后来被证实是原癌性白血病蛋白(PML)癌基因域(PMD)。核蛋白。 Daxx广泛分布于哺乳动物和人类正常组织细胞和肿瘤细胞中,并在细胞凋亡,转录调节和病毒感染中起重要作用。 Daxx作为重要的信号分子,可以在细胞质介导的肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员中介导促凋亡信号的转导,并且还可以作为细胞核中的转录调节因子来调节转录调控中的转录。抑制或转录激活的双重功能通过易位,化学修饰,染色体调控以及与转录因子或转录相关蛋白的直接相互作用在转录调控中发挥作用。 Daxx广泛分布在哺乳动物和人类正常细胞和肿瘤细胞中,并在血液系统疾病中广泛表达。作为Fas受体胞质死亡域结合蛋白,Daxx可以通过Fas-Daxx-ASK1-JNK途径促进细胞凋亡。 Daxx还可以发挥抗凋亡作用。在具有Daxx基因缺失的小鼠中,胚胎干细胞发生凋亡,无法正常发育。 Daxx可以结合转录相关蛋白或相关因子(例如E2A,Ets-1,Pax3和Pax5)来调节转录激活或转录抑制。

研究表明,Daxx与细胞分化有关。 Daxx通过与转录因子E2A结合来抑制E2A的功能,从而抑制关键的成肌基因的表达并减少肌管的形成,抑制肌发生并参与肌细胞分化过程。 Daxx可以促进卵巢癌细胞的生长及其化学抗性,Daxx可以通过抑制自噬来促进前列腺癌。关于Daxx在血液肿瘤中的作用的研究很少。

人白血病K562细胞系是慢性粒细胞白血病的典型细胞系,在体外受相关药物诱导时,具有分化为多个方向的潜力,例如巨核细胞,单核或类红细胞。 K562细胞可用作巨核细胞分化模型。 PMA是蛋白激酶C(PKC)的激动剂。 PMA可以诱导K562细胞分化为具有巨核细胞特征的细胞。 PKC是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,它参与多种信号转导途径,在细胞生长,分化和细胞因子分泌中起重要作用。 ERK是经典的MAP信号转导分子,介导多种细胞生物学过程,包括细胞生长,存活,分化和炎症反应。在PMA诱导的K562细胞分化为巨核细胞期间,ERK信号通路通常被激活。目前,有许多因素影响PMA诱导的K562细胞向巨核细胞的分化。 KRAB-ZFP是重要的转录调节因子。 ZNF300是典型成员。它在PMA诱导的K562细胞分化过程中被上调,并参与K562细胞的调节。巨核细胞分化。电离辐射可以促进PMA诱导的K562细胞巨核细胞分化,并且MAPK信号通路中的ERK和P38MAPK参与了这一过程。 7号染色体开放阅读框41(C7ORF41)的过表达促进佛波酯诱导的K562细胞巨核细胞分化,并增加p-ERK和JNK的蛋白质水平。在PMA诱导的巨核细胞分化过程中,线粒体功能显着改变,ROS水平显着增加,线粒体膜电位降低,呼吸链复合物IV活性降低。关于Daxx和K562细胞之间巨核细胞分化的关联研究尚未见报道。

为了研究Daxx在K562细胞中的作用,建立了稳定表达Daxx的K562细胞系。 CCK8的结果表明,Daxx过表达后细胞活力显着降低。 PMA诱导K562细胞分化为巨核细胞。发现在巨核细胞分化过程中p-ERK的表达增加而Daxx的表达降低,表明Daxx抑制了K562细胞向巨核细胞的分化。 PMA诱导Daxx-K562细胞后,分化的细胞数量减少,细胞巨核细胞中CD41和CD61的表达明显降低,进一步表明Daxx参与了抑制K562细胞向巨核细胞分化的作用。 Westernblot结果表明,Daxx过度表达后,PMA诱导K562细胞分化为巨核细胞,而p-ERK的蛋白水平下降,这表明Daxx可能通过下调p-ERK抑制K562细胞分化为巨核细胞,但相关深入研究作用机理尚需进一步研究。

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